甘薯根際土壤微生物群落結構及多樣性分析

崔紀超,武小霞,林 怡,鐘玉揚,余金姜,王義祥,中 奕,黃 枝

(1.莆田市農業科學研究所，福建 莆田 351144；2.福建省農業科學院農業生態研究所/福建省紅壤山地農業生態過程重點實驗室，福州 350013)

【研究意義】土壤微生物參與有機質分解與合成、養分固定與釋放等過程[1]，是土壤分解系統的主導者，在推動土壤物質轉換和能量流動中具有重要作用[2]。土壤微生物群落結構和功能多樣性對土壤微生態環境的改善和土壤的可持續利用至關重要[3]。根際是植物根系與土壤間物質、能量轉換的直接界面[4-5]，根際微生物與植物健康、病蟲害防御和產量等密切相關[6]。甘薯[Ipomoeabatatas(L). Lam.]是旋花科無性繁殖塊根植物，是全球第六大糧食作物，在世界糧食安全中起著十分重要的作用[7]。因此研究甘薯根際土壤微生物群落組成和多樣性對保障甘薯生產和促進甘薯產業發展具有重要意義。【前人研究進展】對于土壤根際微生物多樣性及結構功能的多樣性研究，傳統方法是可培養法，先將微生物進行分離純化，然后根據菌落形態和數量獲得可培養微生物的種類和數量信息[8]，但根際土壤環境復雜，很難在室內重現，絕大多數土壤微生物無法在實驗室培養[9]。磷脂脂肪酸分析法(PLFA)、梯度凝膠電泳(DGGE)技術、基于核酸分子雜交、PCR技術和Sanger等方法檢測到的細菌群落范圍較小，且操作復雜，或成本高[10]。第二代高通量測序技術獲得的基因序列數多，可檢測到不可培養和痕量微生物，具有高通量、高靈敏度和高準確率等優點，已成為研究根際微生物群落多樣性的重要手段[11-13]。Zhang等[14]認為每種植物都有一個特定的根際微生物組，Pérez-Jaramillo等[15]研究認為同一物種不同基因型間根際微生物組成不同。有研究表明，甜菜[16]、大麥[17]、向日葵[18]、菜豆[19-20]等植物的野生種和現代栽培種根際微生物群落有很大差異。邱潔等[21]運用高通量測序分析了3個不同品種桑樹根際土壤細菌的多樣性，結果顯示不同品種根際土壤細菌群落和結構存在一定差異。張旭龍等[22]研究顯示，不同油葵品種根際土壤微生物多樣性不同?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關甘薯根際土壤微生物多樣性的研究尚無報道?！緮M解決的關鍵問題】對不同品種甘薯根際細菌的16S rDNA和真菌的ITS基因序列V3～V5高變區進行PCR擴增，并對PCR擴增產物進行高通量測序，分析土壤中細菌和真菌多樣性，了解甘薯根際土壤細菌和真菌的群落結構、物種組成和差異，為促進甘薯的生長發育和培育高品質甘薯品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗品種為：黃肉品種龍薯24(Longshu24)、紅肉品種普薯32(Pushu32)和紫肉品種福寧紫3號(Funingzi3)。

1.2 試驗設計與方法

試驗地位于福建省莆田市荔城區黃石鎮清前村，該區屬亞熱帶季風氣候，年均氣溫18～21 ℃，年均降雨量1200～1600 mm，供試土壤為粘壤土，肥力中等。2019年在7月20日完成整地，畦寬1 m，畦長5.8 m，小區面積46.4 m2，每個品種種植280株，8月10日進行田間種植。1月10日進行土壤樣品采集，采用五點取樣法，每個小區設置5個采樣點，隨機取6株甘薯，去除地表0～5 cm的土壤，將甘薯植株連同周圍的土體取出，抖掉根系外圍土，取根表附近的土壤，剔除石礫和植物殘根等雜物，5個采樣點土壤混勻后運用四分法取樣取500 g土裝入無菌袋，立即帶回實驗室。每個品種分成2份，1份用于測定土壤基本理化性質，1份用于分析土壤微生物群落多樣性。龍薯24、普薯32和福寧紫3號土壤樣本編號分別為Longshu24、Pushu32和Funingzi3，提取土壤微生物DNA后委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行MiSeq高通量測序。

1.3 土壤理化指標測定

土壤pH采用pH計測定(水土比為2.5∶1.0)，土壤水分含量采用重量分析法，電導率(EC值)采用電導率儀測定(水土比5∶1浸提)[23]，總碳和總氮采用元素分析儀(Vario EL Cube，德國，Elementar)測定[24]。

1.4 土壤微生物群落測定

采用土壤DNA試劑盒(Omega Bio-tekInc，Doravilla，GA，USA)提取土壤細菌和真菌總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的土壤微生物總DNA質量，然后將DNA送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行MiSeq高通量測序。細菌16S rDNA擴增引物為338F-806R(F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，R： 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，真菌擴增引物為ITS1F-ITS2R(F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。

1.5 生物信息統計與分析

在上海美吉生物醫藥科技有限公司的生物云分析平臺(www.majorbio.com)，利用QIIME(version 1.17，http://qimme.org)軟件對測序數據進行分析?；贗llumina分析平臺對Fasta等相關文件原始數據進行過濾處理，提取沒有重復的單序列，優化得到的序列和去除嵌合體序列。在相似水平為97%條件下聚類非重復序列的操作分類單元(Operational taxonomic units，OTU)，獲得OUT代表序列，采用RDP(Ribosomal database project) classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行多樣性指數分析，選擇置信度閾值0.7，比對數據庫(Silva 132/16s bacteria)。按照最小樣品序列數對數據進行抽平處理，計算α多樣性指數(ACE、Chao1、Shannon和Simpson)，采用Mothur軟件(version v.1.30.1)稀釋性分析，并制作曲線圖和韋恩圖[19, 25]，利用Metastats對門和屬水平的群落分類學組成和豐度進行分析[26]。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物樣品測序結果

通過MiSeq高通量測序并優化后，3個品種根際土壤樣品細菌共獲得有效序列123 309條，總堿基數為51 386 363 bp，平均堿基長度為416.7447 bp(表1)；真菌共獲得有效序列178 783條，總堿基數42 829 437 bp，平均堿基長度為239.9962 bp。采用97%的序列相似度作為OTU劃分閾值，在門分類水平上，3個品種土壤樣品供獲得2978個細菌OTUs和686個真菌OTUs，細菌種數遠大于真菌。根據稀釋曲線(圖1)可知，隨著測序數量的增加曲線趨于平緩，即再增大測序深度也不會增加新的OTU數量，說明試驗已獲得絕大多數樣本信息，已經能夠反映土壤樣品的微生物群落組成，測序數據合理。

表1 測序數據統計

圖1 相似度為0.97條件下土壤細菌和真菌Sobs指數稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of soil bacterial and fungal community(at 97% identity) constructed Sobs index

通過維恩圖分析(圖2)可知，龍薯24、普薯32和福寧紫3號3個品種根際土壤中細菌分別檢測到2126、2146、2286個OUTs，總數差別不大；3個樣本共有的OTUs為1373個，特有的OTUs數分別為226、208、337個，分別占各自樣本總OTUs的10.63%、9.69%、14.74%。真菌OTUs分別為408、436、377個，共有的OTUs為184個，特有的OTUs數分別為103、128、104個，分別占各自樣本總OTUs的25.25%、29.36%、27.59%。這說明不同品種間細菌和真菌群落均具有一定的差別。

圖2 土壤細菌和真菌群落組成Venn圖Fig.2 Venn diagram of soil bacterial and fungal community composition

2.2 土壤微生物群落Alpha多樣性分析

從表2可以看出，不同甘薯品種細菌豐富度指數(Chao1指數和ACE指數)和多樣性指數(Shannon指數和Simpson指數)變化與OTU變化一致，均為福寧紫3號>普薯32>龍薯24；真菌豐富度指數多樣性為普薯32>龍薯24>福寧紫3號。

表2 土壤樣本Alpha多樣性指數

2.3 土壤微生物群落結構組成分析

2.3.1 細菌群落結構組成分析 根據土壤微生物基因組DNA序列分類學分析結果，2978個細菌OTUs隸屬于33門91綱222目364科630屬1248種。

在門水平上，將平均相對豐度小于0.1%類群歸為其他，共得到17個類群(圖3)，相對豐度均﹥1%的優勢類群有7個，分別為變形菌門(Proteobectria，18.83%～29.65%)、綠彎菌門(Chloroflexi，20.50%～25.85%)、放線菌門(Actinobacteria，15.52%～18.57%)、酸桿菌門(Acidobacteria，10.86%～21.59%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，5.22%～6.72%)、厚壁菌門(Firmicutes，3.23%～4.45%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，1.69%～2.88%)。變形菌門、綠彎菌門、放線菌門和酸桿菌門4個菌門相對豐度均大于10%，是絕對優勢菌門，豐度之和達到79.38%～82.21%。

圖3 門水平上土壤樣品細菌群落結構Fig.3 The bacterial community structures of soil at phylum level

從不同品種看，主要優勢菌群基本保持穩定，但相對豐度具有一定差異，龍薯24根際土壤中優勢菌門(相對豐度大于1%)有8個，相對豐度從大到小為：綠彎菌門(23.22%)>酸桿菌門(21.59%)>變形菌門(18.83%)>放線菌門(18.57%)>芽單胞菌門(5.67%)>厚壁菌門(4.03%)>擬桿菌門(1.69%)>疣微菌門(Verrucomicrobia,1.19%)；普薯32優勢菌門有9個，相對豐度由大到小為：變形菌門(29.65%)>綠彎菌門(20.5%)>放線菌門(18.37%)>酸桿菌門(10.86%)>芽單胞菌門(6.73%)>厚壁菌門(4.45%)>擬桿菌門(2.88%)>己科河菌門(Rokubacteria,2.09%)>硝化螺旋菌門(Nitrospirae,1.09%)。福寧紫3號優勢菌門有9個，相對豐度由大到小為：綠彎菌門(25.85%)>變形菌門(23.48%)>放線菌門(15.52%)>酸桿菌門(15.24%)>芽單胞菌門(5.22%)>厚壁菌門(3.23%)>擬桿菌門(2.54%)>己科河菌門(2.16%)>髕骨細菌門(Patescibacteria,1.13%)。變形菌門和酸桿菌門的相對豐度在3個品種間差距最高可達10.82%和10.73%。

在屬水平上，將平均相對豐度1%%的類群歸為其他(Others)，共得到36個類群(圖4)，有明確分類的有12個，大多數屬未分類鑒別，Others占94.29%。3個品種共有的優勢屬(相對豐度>1%)有11個，不同屬相對豐度從大到小具體為：norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6(3.93%～10.62%)、norank_f__Gemmatimonadacae(2.62%～4.20%)、norank_f__Anaerolineaceae(1.72%～4.28%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，2.43%～3.98%)、norank_f__Roseiflexaceae(2.13%～4.07%)、Gaiella(1.775%～3.11%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，1.72%～2.56%)、norank_f__norank_o__SBR1031(1.57%～3.26%)、norank_f__norank_o__Gaisllales(1.03%～2.52%)、norank_f__norank_o__norank_c__TK10(1.58%～1.97%)和norank_f__norank_o__Subgroup_7(1.14%～2.13%)。

從不同品種看，不同品種屬的相對豐度具有一定差異，龍薯24有優勢屬21個，位于前5位的優勢屬為：norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6(10.62%)>鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas,3.98%)>norank_f__Anaerolineaceae(3.91%)>norank_f__Roseiflexaceae(2.73%)>Gaiella(2.62%)；普薯32有優勢屬25個，位于前5位的優勢屬為：norank_f__Gemmatimonadacae(4.2%)>norank_f__Roseiflexaceae(4.07%)>norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6(3.93%)>Gaiella(3.11%)>鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，3.10%)；福寧紫3號有優勢屬21個，位于前5位的優勢屬為：norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6(7.71%)>norank_f__Anaerolineaceae(4.28%)>norank_f__Gemmatimonadacae(3.95%)>norank_f_A4b(3.44%)>norank_f__norank_o__SBR1031(3.26%)。norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6在不同品種間差別最大，龍薯24豐度比普薯32高6.69個百分點。

圖4 屬水平上土壤樣品細菌群落結構Fig.4 The bacterial community structures of soil at genus level

2.3.2 真菌群落結構組成分析 根據土壤基因組DNA序列分類學分析結果，686個真菌OTUs隸屬于13門30綱61目108科163屬213種，種類遠少于細菌。

在門水平上，將平均相對豐度0.1%類群歸為其他，共得到8個類群(圖5)，平均相對豐度均﹥1%的優勢類群共有4個，不同門相對豐度從大到小為：子囊菌門(Asccomycota,57.03%～81.41%)、被孢霉門(Mortierellomycota,9.27%～31.17%)、未分類真菌(5.74%～8.67%)和擔子菌門(Basidiomycota,1.48%～2.44%)。子囊菌門是最絕對優勢菌門，在龍薯24、普薯32和福寧紫3號樣品中相對豐度分別高達81.40%、57.03%和72.24%，不同品種間普薯32比龍薯24高24.27%。

圖5 門水平上土壤樣品真菌群落結構Fig.5 The fungal community structures of soil at phylum level

在屬水平上，將平均相對豐度小于1%的類群歸為其他(Others)，共得到21個類群(圖6)，Others占7.51～8.05%。被孢霉屬(Mortierella,9.00%～30.42%)、籃狀菌屬(Talaromyces,10.98%～23.67%)、鐮刀菌屬(Fusarium,12.79%～17.40%)、unclassfied_k__Fungi(5.74%～8.67%)、unclassfied_c__Sordariomycetes(3.04%～11.48%)、unclassfied_f__Chaetomiaceae(2.00%～6.91%)、unclassfied_f__Hypocreales_fam_Incertae_sedis(2.50%～3.62%)、彎孢屬(Curvularia,1.41%～2.31%)、青霉屬(Penicillium,1.08%～3.01%)、Clonostachys(1.55%～1.70%)、unclassfied_o__Sordariates(1.24%～1.90%)、Saitozyma(1.46%～1.74%)和unclassfied_f__Nectriaceae(1.07%～1.72%)13個屬是3個品種共有的優勢屬。

圖6 屬水平上土壤樣品真菌群落結構Fig.6 The fungi community structures of soil at genus level

不同品種間，龍薯24前5位的屬分別為鐮刀菌屬(17.40%)>unclassfied_c__Sordariomycetes(11.48%)>籃狀菌屬(10.98%)>被孢霉屬(9.0%)>unclassfied_f__Chaetomiaceae(6.91%)，普薯32前5位的屬分別為孢霉屬(Mortierella，30.42%)>鐮刀菌屬(14.31%)>籃狀菌屬(13.47%)>unclassfied_k__Fungi(8.67%)>unclassfied_f__Hypocreales_fam_Incertae_sedis(3.19%)，福寧紫3號前5位的屬分別為籃狀菌屬(3.67%)>孢霉屬(19.15%)>鐮刀菌屬(12.79%)>unclassfied_c__Sordariomycetes(5.79%)>unclassfied_k__Fungi(5.74%)。被孢霉屬在3個品種間差別最大，普薯32比龍薯24高21.42個百分點。蟲草屬(Cordyceps，1.88%)是龍薯24特有的優勢屬，Echria(2.03%)和瓶霉屬(Phialophora,2.07%)是普薯32特有的優勢屬。

2.3.3 土壤微生物Beta多樣性分析 從屬水平對各樣品進行主成分分析，結果(圖7)顯示，3個品種樣品間距離均較遠且處于不同象限，其細菌和真菌群落組成具有明顯差異。細菌PC1和PC2對結果的解釋度分別為70.8%和29.21%，真菌PC1和PC2對結果的解釋度分別為81.99%和18.01%。從樣品分布象限來看，龍薯24均位于第三象限，說明與第1主成分和第2主成分均呈負相關；普薯32位于第四象限，說明與第1主成分呈正相關，而與第2主成分呈負相關；福寧紫3號位于第二象限，說明與第1主成分呈負相關，與第2主成分均呈正相關。

圖7 土壤細菌和真菌群落PCA分析Fig.7 PCA analysis of soil bacterial and fungal community composition

2.4 土壤理化指標與微生物群落多樣性關系分析

由表3可知，土壤含水率、電導率、總氮與Chao1、ACE、Shannon和Sobs指數呈負相關，而與Simposon指數呈正相關，真菌總氮與Chao1指數呈顯著相關，其余相關性均不顯著；pH和總無機碳與Chao1、ACE、Shannon和Sobs指數呈正相關，而與Simpson指數呈負相關，相關性不顯著(P>0.05)；總有機碳與細菌、真菌豐富度指數相關性相反，總有機碳與真菌多樣性呈極顯著負相關。

表3 土壤細菌多樣性與土壤理化性質之間的相關性

3 討 論

土壤微生物群落組成及其多樣性是土壤健康的靈敏性指標[27-28]，由于土壤微生物數量巨大、種類繁多，研究結果受研究方法和技術影響較大。與其他方法相比，高通量測序技術是目前研究土壤微生物多樣性最有效的方法，具有通量高、準確率高、速度快等優點[11-13]，已廣泛應用在大田作物[21-22,29-30]、草地[31]、藥用植物[32]、菌草[33]和鹽堿地等[34-35]土壤微生物多樣性的研究，目前有關甘薯土壤微生物群落組成及其多樣性還未見報道。本研究首次采用高通量測序，對龍薯24、普薯32和福寧紫3號3個不同類型甘薯根際土壤細菌和真菌進行了多樣性分析，列出了細菌和真菌所屬的門和屬不同分類水平上的優勢類群及其相對豐度。研究結果顯示，根際土壤細菌和真菌在門水平上的分類信息比較明確，而在屬水平上尚未明確分類名稱信息和未進行分類的較多，這可能與測序序列長度、測序期間和比對的數據庫有關[36]。

本研究中3個不同品種甘薯根際土壤獲得的細菌隸屬33門91綱222目364科630屬1248種，真菌隸屬13門30綱61目108科163屬213種，細菌的多樣性和豐富度遠高于真菌，這與高雪峰等[37]和于少鵬等[38]報道的土壤中細菌豐富度遠高于真菌的研究結果一致。在門水平上，變形菌門(Proteobectria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)4個菌門相對豐度均大于10%，是細菌絕對優勢門，豐度之和達79.38%～82.21%，這與李丹等[39]、Jangid等[40]、袁紅朝等[41]和劉欣等[42]對農田作物土壤細菌的研究結果基本一致。變形菌門適應能力強，是自然界最普遍的菌門[43]。Xin等[44]和Fierer等[45]認為，在土壤中變形菌門放線菌門主要參與有機質轉化和土壤結構形成等，與碳利用有關。綠彎菌門參與碳、氮、硫的生物地球化學循環和降解土壤有毒物質[46-47]，酸桿菌門參與降解植物殘體多聚物和鐵循環等過程，一般具有寡營養和難培養的特點，多存在于營養貧瘠的土壤環境中[48]。在真菌群落中，相對豐度大于1%的優勢菌門共有子囊菌門(Asccomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、未分類真菌和擔子菌門(Basidiomycota)4個。子囊菌門(Asccomycota)是最絕對優勢菌門，在龍薯24、普薯32和福寧紫3號樣品中相對豐度分別高達81.4%、57.03%和72.24%。這與前人研究報道[49-52]的子囊菌門是多種植物根際真菌優勢群的結論基本一致。子囊菌門作為真菌界種類最多的門，在土壤有機質的降解中具有重要作用[53]，Yelle等[54]認為擔子菌和子囊菌是土壤中主要的真菌分解者。

Coats等[55]認為，不同植物物種或同一物種不同基因型間由于根系分泌物不同，為微生物活動提供的碳底物不同，可導致出現不同的微生物群落結構。本研究中龍薯24、普薯32和福寧紫3號3個不同品種根際土壤中細菌和真菌OTU總數差別不大，但每個品種細菌特有的OTU數分別占各自樣本總OTU的10.63%、9.69%、14.74%，真菌為25.25%、29.36%、27.59%，這說明不同品種間細菌和真菌群落均具有一定的差別。從細菌門水平看，3個品種優勢門(相對豐度>1%)的類型基本一樣，但各個門的相對豐度差別較大，龍薯24、普薯32和福寧紫3號中豐度最大的門分別為：綠彎菌門(23.22%)、變形菌門(29.65%)和綠彎菌門(25.85%)，變形菌門普薯32豐度比龍薯24高10.82%，酸桿菌門龍薯24豐度比普薯32高10.73%，差別均較大。從真菌門水平看，子囊菌門是3個品種最絕對優勢菌門，但在龍薯24、普薯32和福寧紫3號中相對豐度分別為81.4%、57.03%和72.24%，普薯32比龍薯24高24.27%，差別較大。

土壤類型和理化性質改變會引起土壤微生物群落組成發生變化。土壤含水率一方面影響土壤微生物遷移速度和擴散范圍[56]，引起土壤微生物群落發生改變，另一方面改變土壤微生物生活環境，土壤水分過低或者過高均會引起群落組成發生變化[57]。不同pH土壤微生物具有多樣性，Fiere等[58]研究指出，酸性土壤細菌多樣性最低，中性土壤細菌多樣性最高；Rousk等[59]也認為，在一定酸性條件下真菌的耐受性高于細菌。土壤有機質和氮磷鉀等理化性質對土壤微生物群落的影響復雜，目前還沒有完全一致的結論。本研究表明，土壤含水率、電導率、總氮與Chao1、ACE、Shannon和Sobs指數呈負相關，而與Simpson指數呈正相關，真菌總氮與Chao1指數顯著相關，其余相關性均不顯著；pH和總無機碳與Chao1、ACE、Shannon和Sobs指數呈正相關，而與Simpson指數呈負相關；總有機碳與細菌、真菌豐富度指數相關性相反，總有機碳與真菌多樣性呈極顯著負相關。

4 結 論

高通量測序結果表明，不同品種甘薯根際土壤細菌的種類遠大于真菌。變形菌門(Proteobectria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)4個菌門是細菌絕對優勢菌門，子囊菌門(Asccomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、未分類真菌和擔子菌門(Basidiomycota)是真菌優勢菌門，子囊菌門(Asccomycota)是真菌絕對優勢菌門，表明不同甘薯品種根際細菌和真菌數量結構均存在一定差異。