紅豆草苗期耐鹽種質篩選及綜合評價

劉 鑫，汪 堃，梁鵬飛，魏少萍，陳 潔，李景峰，南麗麗

(甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室，蘭州 730070)

【研究意義】土壤鹽漬化的程度嚴重影響植物的生長與發育。在我國農業發展進程中，鹽漬化土壤限制植物的營養吸收，影響植物的生長，嚴重制約著農業的發展[1]?！厩叭搜芯窟M展】鹽脅迫下，植物的形態特征和生理特性等會發生一系列變化。研究發現，開展植物耐鹽能力篩選的兩個關鍵時期分別在萌發出苗[2]和幼苗生長階段[3]。當植物受到鹽分脅迫時，根系是植物表現最敏感且受害最嚴重的器官[4]。陳曉晶等[5]研究發現，在分蘗期、拔節期、抽穗期和灌漿期，耐鹽品種“白燕2號”燕麥其地上部及地下部干重、根總長度、表面積、體積及平均直徑均高于鹽敏感品種“白燕5號”燕麥。鹽脅迫下，植物為維持其生長平衡，通常采用調節滲透物質、改善離子分布、清除多余活性氧等方式以應對脅迫[6]?！颈狙芯壳腥朦c】紅豆草(Onobrychisviciaefolia)是寒旱地區廣泛種植的優質豆科牧草。目前關于紅豆草的研究主要集中在改土效益[7]、病害[8]、干旱[9]、鹽漬[10]、霜凍[11]、耐低磷[12]、草產量及品質[13]等方面，但不同紅豆草材料，其耐鹽能力存在顯著差異[14-15]?！緮M解決的關鍵問題】本試驗以9份紅豆草為供試材料，研究鹽脅迫對紅豆草幼苗生長及生理的影響，確定不同材料耐鹽性差異，為優良耐鹽紅豆草新品種選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅豆草共9份，其中編號1、5、6、7456、9155、9860、9977共7份由農業部全國畜牧獸醫總站牧草種質資源搜集保護項目協作組從俄羅斯瓦維洛夫植物基因庫引進，蒙農紅豆草(Onobrychisviciaefolia‘Mengnong’，MN，育成品種)種子由內蒙古農業大學提供，甘肅紅豆草(O.viciaefolia‘Gansu’，GS，地方品種)種子由甘肅農業大學提供。

1.2 試驗設計

選用消毒后的細沙(121 ℃，高溫滅菌30 min)500 g裝入塑料杯中，消毒(HgCl2溶液)后的紅豆草種子均勻撒播在杯中并覆沙3～4 cm，出苗后每杯選留10株分布均勻且生長統一的幼苗，每隔2 d澆灌50 mL Hoagland營養液。NaCl脅迫處理選擇在30 d后進行，其濃度為0%、0.4%、0.8%和1.2%，連續脅迫處理7 d后采集紅豆草幼苗葉片和根系測定各項指標。

1.3 測定指標及方法

株高(Plant height，PH)用卷尺測定；地上、地下鮮重(Above/Below ground fresh weight，AFW、BFW)采用稱重法；根系形態指標采用臺式掃描儀對根系進行掃描，用根系分析系統軟件獲得根系總長度(Root length，RL)、根系總表面積(Root surface area，RSA)、根系平均直徑(Average root diamater，ARD)、根體積(Root volume，RV)和根尖數(Root tip number，RTN)等。

生理指標參考鄒琦[16]的方法進行，其中可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量采用蒽酮比色法測定，可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定，脯氨酸(Proline，Pro)含量采用酸性茚三酮比色法測定，過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創木酚法測定，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)光化還原法測定，過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測定，K+、Na+含量采用火焰光度計法[17]測定。

1.4 統計分析

利用Excel 2010進行數據分析并做表，采用隸屬函數對供試紅豆草進行耐鹽性綜合評價，利用SPSS 20.0進行相關性分析、聚類分析和主成分分析。為使材料間的差異最小化，各處理采用相對值表示，能準確反映不同材料的耐鹽性，各指標耐鹽系數=處理測定值/對照測定值[18]。

用隸屬函數法進行綜合評價，對與鹽脅迫呈正相關的指標采用公式Fij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)計算；對與鹽脅迫呈負相關指標采用公式Fij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)計算。式中，Fij為i品種的j性狀測定的具體隸屬值；Xij為i品種j性狀測定值；Xjmin為j性狀中測定的最小值；Xjmax為j性狀中測定的最大值。

權重采用客觀賦權法進行計算：Ij=Cj/Sj，式中，Ij是一個無量綱數，表示某評價指標在鹽脅迫下的測定值相對于對照組的比值。Cj為第j個指標正常組的測定值，Sj為第j個指標在某個脅迫處理下所測定的平均值。如果是負相關，則計算式為Ij=Sj/Cj。最后通過歸一化，計算出每個評價指標的權重：Wj=Ij/∑Ij。綜合評價值：D=∑(Fij×Wj)[19]。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對紅豆草幼苗生長的影響

由表1可知，供試植物PH、AFW、BFW、ARD、RV、RSA、RL和RTN耐鹽系數分別在0.71～0.98、0.48～0.92、1.06～2.14、0.58～0.98、1.07～4.85、1.03～1.45、1.06～1.61和1.01～3.02范圍內變化，其中PH、AFW、ARD的耐鹽系數小于1，且隨鹽濃度的增加而不斷降低；其他形態指標的耐鹽系數均大于1，并隨鹽濃度增加而不斷上升。

表1 鹽脅迫下供試材料形態指標耐鹽系數

2.2 鹽脅迫對紅豆草滲透調節物質及MDA含量的影響

由表2可知，供試材料葉片和根系SS、SP、Pro、MDA耐鹽系數分別在0.77～3.95和0.17～0.83、0.81～1.23和1.05～1.60、1.15～3.18和1.16～11.35、1.05～2.05和1.11～3.50范圍內變化。隨鹽濃度的增加，葉片SS、SP耐鹽系數先增加后降低、根系SS耐鹽系數不斷下降，根系SP耐鹽系數不斷增加；葉片Pro耐鹽系數不斷上升，根系Pro耐鹽系數先升后降；葉片、根系MDA耐鹽系數不斷增加。

表2 鹽脅迫下供試材料滲透調節物質和MDA的耐鹽系數

續表2 Continued table 2

2.3 鹽脅迫對紅豆草酶活性及K+、Na+含量的影響

由表3可知，供試材料葉片和根系POD、CAT、SOD、K+、Na+耐鹽系數分別在1.06～3.91和1.09～2.75、1.01～1.48和0.83～0.99、0.93～3.94和1.04～3.30、0.58～0.99和0.31～0.92、2.32～28.40和1.19～17.39范圍內變化。隨鹽濃度的增加，葉片和根系POD、Na+耐鹽系數不斷升高；葉片CAT耐鹽系數不斷增加，根系CAT耐鹽系數不斷降低；葉片SOD 耐鹽系數先升后降，根系SOD 耐鹽系數不斷上升；葉片和根系K+耐鹽系數不斷下降。

表3 鹽脅迫下供試材料抗氧化物酶和K+、Na+耐鹽系數

續表3 Continued table 3

2.4 性狀相關性分析

由表4可知，鹽脅迫下，供試紅豆草材料生長狀況與生理指標間整體相關性密切，但各單項指標表現不一，這表明各單項指標不能準確有效的評價紅豆草耐鹽性的差異，應考慮其綜合性狀所帶來的影響。

表4 鹽脅迫下各性狀的耐鹽系數相關性

2.5 主成分分析

由表5可知，主成分中排名前5的貢獻率分別為38.91%、13.82%、11.80%、8.94%、8.32%，累計貢獻率為81.79%，其中第1、2、3、4、5主成分各自的特征值分別為6.615、2.349、2.006、1.519、1.415，對應較大的特征向量分別是AFW、Pro、POD、RSA、SP，因此這5個指標可作為不同紅豆草耐鹽性篩選與評價的重要指標。

表5 各綜合指標特征根及貢獻率

2.6 綜合評價

2.6.1 隸屬函數分析 由表6可知，對供試紅豆草材料鹽脅迫能力進行隸屬函數綜合評價，結合17項指標的隸屬函數加權平均值對其耐鹽能力強弱排序結果為：材料9860>9977>GS>6>7456>5>9155>MN>1。

表6 鹽脅迫下各指標隸屬值及綜合評價

續表6 Continued table 6

2.6.2 聚類分析 通過歐式距離平方法及系統聚類法對不同紅豆草材料隸屬值進行系統聚類分析(圖1)，將9份材料轉化為3類，第1類：耐鹽性較強，包括材料9860和9977；第2類：耐鹽性中等，包括材料GS、6、7456、5、9155；第3類：耐鹽性較弱，包括材料MN和1。

圖1 不同紅豆草材料耐鹽性聚類圖Fig.1 Cluster diagram of different sainfoin materials based on comprehensive evaluation value

3 討 論

3.1 鹽脅迫對紅豆草幼苗生長的影響

根系是植物營養物質吸收與傳送的主要器官，其形態結構的變化影響植物的生長狀況[20]。本研究表明，隨鹽脅迫濃度增加，供試材料的PH、AFW、ARD均下降，而BFW、RV、RSA、RL和RTN均增加，表明鹽分過量引起滲透脅迫和離子毒害，使植物生長緩慢，其PH和AFW均下降，抑制了地上部的發育；植株需要消耗更多的能量和有機物質以支持根系吸收水分和養分，改變了生物量分配格局，使BFW增加，這與賈茵等[21]對小報春耐鹽性的研究結果相一致。

3.2 鹽脅迫對紅豆草滲透調節物質及MDA的影響

鹽脅迫下，植物細胞內部可溶性滲透調節物質(如Pro、SS、SP)加速積累，從而降低胞內滲透勢確保水份能夠正常吸收[22]。有研究表明，植物體內的SS只作為耐鹽性的參考指標[23]，本研究中，SS與鹽害指數的相關性不緊密，表明其在植物耐鹽性中的影響較低；本研究中，鹽脅迫下葉片SP含量先升后降，這是由于低濃度脅迫下SP合成增強并參與滲透調節，提高紅豆草抗逆性，保護自身機制免受傷害；當脅迫濃度超出一定范圍，SP合成受阻，紅豆草的自我調節機制受到破壞，使幼苗生長受到影響[24]。逆境下Pro含量增加能增強植物對逆境的抵御作用[25]。本研究中，鹽脅迫下葉片和根系Pro含量均大于CK，表明Pro有效抵御了鹽脅迫對植物的傷害；葉片Pro含量不斷升高、而根系Pro含量先升后降，這是植物自身采取的一種保護措施，當鹽濃度超過一定范圍后，其Pro含量降低，植物的自我保護已被破壞[26]。

MDA是膜質過氧化的最終產物。Fu等[27]研究認為，植物在受到鹽分脅迫時會引起細胞的膜透性和完整性遭到破壞，導致膜脂過氧化。本研究中，鹽脅迫下材料6的膜脂過氧化程度較低，材料MN和9155的過氧化程度較高，其他植物居中。

3.3 鹽脅迫對紅豆草抗氧化酶活性及離子含量的影響

逆境條件下，植物為了維持體內的平衡，在SOD、POD 等抗氧化酶的協同作用下建立防御系統，清除體內過剩的活性氧[28]。本研究表明，鹽脅迫后各植物葉片和根系POD、葉片CAT及根系SOD活性均高于CK，受損的膜在活性氧清除速度快于其產生速度的狀態下得到修復，使脅迫程度得到了緩解。

鹽脅迫下，維持植物體內較高K+/Na+是評價植物耐鹽性的一個重要指標[10]。本研究中，低鹽脅迫(0.4%)下，紅豆草幼苗通過維持體內K+、Na+穩態平衡抵御鹽脅迫；而在高鹽(0.8%、1.2%)脅迫下，紅豆草地上地下積累大量Na+，但因Na+區域化分布嚴重，環境影響滯后K+的運輸，植物體內K+、Na+穩態平衡被打破，產生離子毒害效應，導致植物生長受限[29]。

3.4 植物耐鹽性綜合評價

植物耐鹽性是一個復雜的過程，為避免利用單項指標描述耐鹽性的局限性，本試驗通過隸屬函數分析對供試材料耐鹽性進行綜合評價，利用該法對植物抗逆能力進行評價已在花生[30]、薄荷[31]等中得到應用。

4 結 論

紅豆草耐鹽性與形態特征和生理生化密切相關，隸屬函數綜合評價得出9份材料耐鹽性強弱順序為材料9860>9977>甘肅紅豆草>6>7456>5>9155>蒙農紅豆草>1。其結果可為耐鹽紅豆草新品種選育提供新種質。