PD-1/PD-L1通路在自身免疫性眼病中作用的研究進展

楊辰玲，周慧芳

上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院眼科，上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室，上海 200011

自身免疫性眼病是一組機體對自身抗原產生免疫反應而導致眼表、眼內及眼眶周圍組織受到損害的疾病，主要包括自身免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveitis）、 甲狀腺相關眼病（thyroid-associated ophthalmopathy）、干燥綜合征（Sj?gren's syndrome）、視神經脊髓炎譜系障礙（neuromyelitis optica spectrum disorder）、免疫性角膜炎等。它們的發病機制雖不盡相同，但均體現為機體免疫耐受的破壞和免疫穩態的失衡。在自身免疫反應中，T 細胞起到重要作用。雖然人體的中樞耐受機制消除了大多數自身反應性T細胞，但仍有小部分針對自身抗原的特異性T細胞逃逸到外周環境中［1］。機體為了抑制自身免疫的發生，多種調節機制參與其中，包括克隆無能、克隆缺失以及調節性T細胞的抑制作用［2］。

在特異性細胞免疫中，T 細胞激活需要雙信號［3］。第一信號由抗原肽/主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC） 與T 細胞受體（T cell receptor，TCR）的相互作用形成，賦予T 細胞免疫應答特異性，同時也進行抗原識別。第二信號是獨立于抗原的“共刺激信號”，通過抗原提呈細胞上表達的共刺激分子與T細胞上的相應受體結合進行傳遞［4］。已知的共刺激分子包括CD28、細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4，CTLA-4）、誘導性共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）、程序性死亡蛋白-1（programmed death 1，PD-1）等［5］。共刺激信號不僅可以提供促進T細胞活化的第二信號，還能夠提供抑制T 細胞應答的信號，直接或間接地介導T 細胞耐受，從而防止自身免疫反應的發生［6］。其中，PD-1及其配體程序性死亡蛋白配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）作為負調控共刺激分子，在參與免疫調節、調控T細胞免疫應答和自身免疫性疾病的發生發展中起了重要作用。2002 年，中國陳列平教授指出大多數腫瘤細胞通過PD-1通路實現免疫逃逸［7］。自此，研究者開始重視該領域并研究相關腫瘤治療藥物［8］。近年來的研究［9］表明，PD-1/PD-L1 通路的失活導致多種自身免疫性疾病的發生，包括系統性紅斑狼瘡、1 型糖尿病、多發性硬化等。2005 年，干燥綜合征的研究發現PD-1 與其具有相關性［10］；此后，在其他自身免疫性眼病中也有類似發現。本文將對PD-1/PD-L1 通路及其在自身免疫性眼病中的研究進展作一綜述。

1 PD-1/PD-L1/2信號的生物學效應

1.1 PD-1及其配體PD-L1/2

PD-1即CD279，是一種由288個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，為CD28 家族成員，相對分子質量為55 000；由胞內胞外兩部分組成，胞外段為一個IgV樣結構域，胞內段存在免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM） 以及免疫受體酪氨酸轉換基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM）。PD-1 可以在T 細胞、B 細胞、自然殺傷性T 細胞、活化的單核細胞和樹突狀細胞（dendritic cell，DC）上表達。PD-1 在靜止的T 細胞上不表達，但在激活后可誘導表達［11］。

PD-L1（又稱B7-H1 或CD274）和PD-L2（又稱B7-DC 或CD273）作為PD-1 的2 種配體，同為B7 家族成員，均為典型的由免疫球蛋白恒定區和可變區組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白結構［12］。PD-L1 在多種細胞中廣泛表達。在免疫細胞中，B 細胞、DC、巨噬細胞、骨髓衍生的肥大細胞和T 細胞上均普遍存在PD-L1的表達，并可在細胞被激活后進一步上調。同時，PDL1 也可以在多種非免疫細胞中表達，包括血管內皮細胞、成纖維細胞、視網膜色素上皮細胞等，這些細胞均可成為自身免疫性眼病的靶細胞。與PD-L1 相比，PD-L2 僅在較少的細胞類型中表達，如活化的DC、巨噬細胞、骨髓來源的肥大細胞和記憶性B 細胞，且表達水平較低［6］。

PD-L1和PD-L2對PD-1的親和力不同，PD-L2對PD-1 的親和力為PD-L1 的3 倍。由于結合位點重疊，已有研究［13］為B7/CD28 家族的免疫調節功能增加了新的調節途徑，即B7-1 和PD-L1 之間可以結合產生雙向抑制作用，能夠抑制T細胞的活化和細胞因子的產生。

1.2 PD-1信號通路的生物學效應和免疫調節機制

PD-1/PD-L1通路可以調節免疫能力，有效維持T細胞活化，實現免疫耐受和組織損傷之間的平衡，預防自身免疫反應和慢性感染的發生［6］。但是，該通路也可以被腫瘤細胞利用，腫瘤細胞上的PD-L1 與T細胞表面的PD-1 結合后，可以抑制T 細胞激活和增殖，誘導T細胞的凋亡，使腫瘤可以逃避機體的免疫攻擊，在機體內存活、增殖［14］。

T 細胞功能的發揮依賴于細胞因子的產生，PD-1表達水平的改變可以通過共刺激途徑調控T 細胞功能。PD-1 低表達會抑制γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的產生，同時降低細胞毒性；PD-1極低表達則會抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素2（interleukin 2，IL-2） 的產生，同時抑制T 細胞增殖。此外，PD-L1 也可影響T 細胞功能。FRANCISCO 等［15］提出PD-L1可以誘導初始CD4+T 細胞轉化為誘導型調節性T細胞（induced regulatory T cell，iTreg），iTreg 的免疫調節功能是抑制效應T 細胞產生外周耐受的關鍵。

探究PD-1 通路抑制自身免疫性疾病的機制是近年來的研究熱點。PD-1 通過招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2［9］，抑制TCR 近端酶的激活及下游事件啟動，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB 或PI3K/AKT）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是其中最經典的2 條信號轉導通路。蛋白磷酸酶和張力蛋白同系物（protein phosphatase and tensin homolog，PTEN）是一種細胞磷酸酶，PD-1活化可使PTEN 的活性增強，進一步抑制PI3K/AKT信號通路的激活［16］。此外，PD-1 阻斷PI3K/AKT 通路會抑制細胞抗凋亡基因BCL-XL（B-cell lymphoma/leukemia-x long），引起IL-2 的生成減少，進一步誘導CD8+T 細胞和CD4+T 細胞無能。MAPK 信號轉導通路是PD-1/PD-L1 通路介導抑制作用的另一個關鍵信號靶點，參與細胞外信號向細胞內應答的轉換，并通過磷酸化激活來調控細胞增殖、分化、侵襲、轉移和死亡。c-Jun 氨基端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，c-Jun）、p38 MAPK 和胞外信號調節激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）是參與MAPK 通路的3 條平行通路分子［17］。PD-1 與PD-L1的相互作用可以通過促進ERK 磷酸化，激活酪氨酸激酶，以自分泌或旁分泌形式持續產生活化配體，引起Ras 突變和B-Raf 突變，從而導致腫瘤的發生以及腫瘤耐藥性的產生［18-19］。STUTVOET 等［20］也發現PD-1/PD-L1 軸與MAPK 通路存在關聯，抑制MAPK通路可抑制肺腺癌細胞中表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和IFN-γ 誘導的PD-L1mRNA和蛋白的上調。

此外，PD-1 介導的抑制信號取決于TCR 信號的強度，低水平的TCR 刺激下會產生更大的抑制作用，CD28 或IL-2 的共同刺激則可以減弱PD-1 的抑制作用［21-22］。CD28 和IL-2 都通過影響細胞抗凋亡作用、細胞周期和細胞因子基因來促進T 細胞擴增。

2 PD-1與自身免疫性眼病

2.1 自身免疫性葡萄膜炎

葡萄膜炎可按病因學分為感染性葡萄膜炎和非感染性葡萄膜炎，其中后者主要與自身免疫反應有關，包括自身免疫性葡萄膜炎、特發性葡萄膜炎、風濕性疾病伴發的葡萄膜炎、創傷繼發性葡萄膜炎和偽裝綜合征等［23］。自身免疫性葡萄膜炎的病變部位廣泛，嚴重時可致盲，主要發病機制是由于包括Th1 和Th17 在內的T 細胞亞群失調和功能障礙［24-25］。致病性Th17 細胞為CD4+T 細胞中一個亞型［26］，研究［27］發現其與自身免疫性葡萄膜炎發病相關：致病性Th17 細胞分泌的IL-17 可能引起視網膜色素上皮細胞功能障礙，從而導致疾病的發生發展。

在自身免疫性葡萄膜炎患者中，外周血淋巴細胞中PD-1、PD-L1及PD-L2的mRNA 表達降低，活動期患者降低幅度更大［28］。對實驗性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）小鼠模型的研究［29］發現，PD-1 在正常和EAU 小鼠的視網膜中均表達，而在炎癥活動期，PD-L1 和PD-L2 在眼部浸潤的炎癥細胞、血管和視網膜中表達明顯降低。LEE等［30］發現抑制自身免疫反應可以使EAU炎癥好轉，PD-1 及其配體在眼部的高表達與EAU 由活動期向靜止期轉變有關：Treg被共刺激分子和細胞因子刺激分化為iTreg，iTreg 通過上調PD-1 和PD-L1 的表達抑制T 細胞的自身免疫反應，隨后導致效應T 細胞的IFN-γ 產量減少，轉化生長因子-β 分泌增多，最終使EAU疾病進程中止。

除基礎研究外，在近幾年臨床癌癥免疫療法的相關報道中，PD-1 抑制劑針對癌細胞的T 細胞反應導致的自身免疫性并發癥時有發生，進一步表明PD-1通路的失效可能與自身免疫性葡萄膜炎的發生發展有關。自2014年9月美國食品藥品監督管理局批準使用PD-1 抑制劑帕博利珠單抗（pembrolizumab）以來，有多個研究［31-33］表明葡萄膜炎是PD-1 抑制劑的不良反應之一。

2.2 甲狀腺相關眼病

甲狀腺相關眼病是一種自身免疫性眼眶病，涉及多系統損害，與甲狀腺疾病密切相關，發病率在成年人眼眶疾病中居第一位［34］。此前研究發現，甲狀腺相關眼病的發病包括以下機制：機體對自身促甲狀腺激素受體（thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR）的耐受遭到破壞，抗原提呈細胞及B 細胞對TSHR 表位進行識別，初始Th 細胞被TSHR 肽段激活，分化為不同的亞群，即產生IFN-γ 的Th1 細胞、產生IL-4 的Th2 細胞和產生IL-17A 的Th17 細胞。外周血CD34+纖維細胞浸潤眼眶結締組織，轉化為CD34+成纖維細胞，產生趨化因子募集Th1和Th17細胞。Th 細胞產生的細胞因子與漿細胞產生的自身抗體共同作用于眼眶成纖維細胞，從而加劇眼眶炎癥［35］。

研究證實甲狀腺相關眼病患者外周血CD4+、CD8+T細胞表面PD-1表達率較對照組下降，活動期及中重度患者經糖皮質激素沖擊治療后外周血CD4+、CD8+T細胞表面PD-1表達上調，可能是通過抑制該疾病的自身免疫反應發揮作用［36］。Treg即CD4+CD25+T細胞［37］，占外周血CD4+T 細胞的5%～10%，Treg 功能障礙已被證明是多種自身免疫性疾病發病的重要危險因素［38］。作為T 細胞激活負調控的免疫檢查點，CTLA-4 在Treg 上表達［39］。而且，重度甲狀腺相關眼病患者眼眶組織及外周血CTLA-4 表達低于輕度患者，推測CTLA-4 參與甲狀腺相關眼病的發生發展［40］。SAGIV 等［41］描述了3 例接受免疫檢查點抑制劑治療的癌癥患者，均在接受CTLA-4 抑制劑和PD-1 抑制劑的組合治療后出現甲狀腺相關眼病樣眼眶病變。CTLA-4 與PD-1 同為T 細胞負調控共刺激分子，因結合位點重疊，兩者間存在相互抑制作用，該抑制作用可能導致Treg 無法活化，具體機制尚不明確［13］。上述研究均提示阻斷PD-1/PD-L1 通路可能導致甲狀腺相關眼病的發生及發展。

2.3 干燥綜合征相關型干眼癥

干燥綜合征作為一種系統性自身免疫性疾病，以免疫細胞浸潤并破壞各外分泌腺體為主要特征。當該疾病累及眼部時，表現為干眼癥，患者以畏光、眼干等不適為主，為干燥綜合征相關型干眼癥［42］。其發病機制尚不明確，且無統一診斷及治療標準。

KOBAYASHI 等［10］研究表明干燥綜合征的發生可能與PD-1/PD-L1 通路功能障礙有關。其研究發現干燥綜合征患者唾液中淋巴細胞數量明顯高于健康對照組，淋巴細胞中PD-1 的表達水平明顯高于健康對照組；同時，PD-L1在患者的唾液腺導管和腺泡上皮細胞中高表達，但在正常唾液腺中不表達；相較于無淋巴細胞浸潤的唾液腺，PD-L1在有淋巴細胞浸潤的唾液腺中表達更高。另有研究［43］表明，PD-1/PD-L1作為抑制性共刺激分子，在干燥綜合征患者中作為保護性分子繼發性增多，并與疾病損害程度及預后相關；PD-L1 的表達水平與炎癥嚴重程度呈負相關，PD-L2 則與炎癥嚴重程度無明顯相關性。提示PD-1/PD-L1通路可能在干燥綜合征的免疫病理損害中起保護作用：淋巴細胞持續大量的局部浸潤，過度活化的T 細胞導致PD-1 及其配體繼發性上升，PD-1/PD-L1發揮免疫負調控，限制自身免疫性疾病的發生發展。

2.4 視神經脊髓炎譜系障礙

視神經脊髓炎譜系障礙是由自身免疫反應導致的中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病。該疾病以視神經與脊髓同時或相繼受累為臨床特征，是急性或亞急性起病的致盲性疾病。特異性水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）抗體（AQP4-IgG）為該病的免疫標志物，研究發現其由CD19+CD27hiCD38hiCD180-表型的B 細胞亞群產生；IL-6在視神經脊髓炎譜系障礙患者中表達升高，可提高該B 細胞亞群的存活率以及其AQP4-IgG 的分泌［44］。在動物模型中進一步發現：通過共刺激分子（例如CD80 和CD40）和細胞因子（例如IL-6 和IL-17）的協同作用，T 細胞分化為AQP4 特異性T 細胞，其可導致血-腦脊液屏障的破壞，使AQP4-IgG 和其他的免疫因子進入AQP4 高表達的區域，從而引起炎癥反應［45］。

研究［46］發現，PD-1 和PD-L1 的可溶性形式（sPD-1 和sPD-L1）可能對PD-1/PD-L1 通路有抑制作用：視神經脊髓炎譜系障礙患者早期外周血中，CD4+T細胞表面PD-1，CD19+B淋巴細胞和CD14+單核細胞表面配體PD-L1的表達水平較正常對照組明顯升高，且患者外周血中sPD-1 和sPD-L1 水平明顯高于對照組。另一研究［47］也證實，sPD-1 和sPD-L1 可通過抑制PD-1/PD-L1 通路增強T 細胞活性。故該抑制作用可能在一定程度上干擾了細胞膜上的PD-1/PD-L1負信號轉導，破壞免疫調節穩態，從而導致自身免疫反應［48］。

3 PD-1/PD-L1 在自身免疫性眼病治療中的臨床應用展望

PD-1/PD-L1 通路在自身免疫調節、腫瘤免疫及慢性病毒感染中均起著重要的作用，是自身免疫性疾病和腫瘤的潛在藥物治療靶點。在自身免疫性眼病領域，未來或可能進一步通過對PD-1 這一靶點的深入研究，實現精準診斷與靶向治療。

在評估疾病活動性方面，有研究［49］發現，在1型糖尿病的緩解期患者中，外周血CD4+和CD8+T 細胞中的PD-1 和PD-L1 表達較活動期有所上調。盡管具體機制尚不清楚，但這些結果提示：PD-1+和PDL1+在各亞型的T 細胞中表達的變化可能與緩解期患者自身免疫反應的減弱有關。該現象在自身免疫性葡萄膜炎患者和甲狀腺相關眼病患者的外周血中也同樣存在［28-29，36］。因此，有望將PD-1 或PD-L1 作為一種生物標志物，聯合其他在緩解期階段表達發生變化的潛在靶標，通過免疫學指標定量對患者疾病分期做出精準判斷，為自身免疫性疾病提供新的有效診療策略。

靶向治療方面，在類風濕性關節炎小鼠模型中已證實：PD-1與PD-L1在合適濃度下可抑制滑膜及滑膜液中的T細胞增殖，而PD-1在模型小鼠滑膜T淋巴細胞中的表達異常增強，使得自身免疫反應進展；通過腹膜內注射PD-L1融合蛋白結合異常升高的PD-1，可使小鼠發生關節炎的嚴重程度降低。PD-L1融合蛋白通過結合PD-1 傳遞抑制信號，能夠抑制T 細胞的增殖，降低炎癥細胞因子IFN-γ和IL-17A水平，最終通過調節Th1/Th17 途徑有效控制疾病的發展。因此，有望將注射PD-L1 融合蛋白作為一種新的治療手段，降低炎癥細胞因子，抑制自身免疫反應，從而緩解疾病［50］。

4 結語

自身免疫性眼病的病程較長，嚴重時可致盲，嚴重影響患者的生存質量，且現有治療手段效果不理想，因此對單抗及免疫抑制劑的研究具有重要價值。PD-1/PD-L1 信號通路作為T 細胞激活、誘導及維持免疫耐受的關鍵調控因子，已被證明其在自身免疫反應、腫瘤免疫、移植免疫、感染免疫等多個方面均發揮著重要作用。PD-1/PD-L1通路的免疫調節機制及其在自身免疫性眼病中的作用表明，未來靶向治療自身免疫性眼病具有巨大的潛力，有待進一步探索研究。