臭氧療法治療神經系統疾病的作用機制研究進展

孫 聞，徐龍河 綜述 劉永哲 審校

臭氧療法是一種無創、無不良反應、低成本治療方法，適當濃度和劑量的臭氧可與脂質等相互作用，產生可控的氧化應激作用，從而增加內源性抗氧化劑，增強局部血流灌注和氧供，具有抗炎、鎮痛、營養和免疫調節特性[1-3]。近年來，臭氧療法已廣泛應用于許多疾病，如慢性皮膚潰瘍、口腔疾病、感染傷口、缺血性疾病和關節問題[4-6]。在神經系統疾病中，臭氧也表現出了良好的保護效應[7]。本文綜述了臭氧對神經系統疾病作用機制的研究進展，旨在為臭氧療法的安全性和有效性提供借鑒和幫助。

1 對神經系統疾病的抗炎作用

1.1 神經炎癥 是中樞神經系統(central nervous system, CNS)在損傷、感染、毒素等各種影響內穩態因素的刺激下產生的復雜免疫反應，持續存在的神經炎癥是神經系統疾病，如神經發育、神經退行性和精神性疾病的病因和病程的共同特性[8]。以往的研究表明，臭氧可能通過免疫調節和激活細胞代謝起到長期持久的抗炎作用，減輕炎癥反應[9]。

有學者證實，臭氧可通過抑制神經炎癥治療神經系統疾病[10]。基于大鼠慢性神經根炎模型，Wang等[11]發現鞘內注射臭氧可以緩解機械性異常痛、減弱性神經根炎，下調脊髓腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-6的過表達，增加環磷酸鳥苷和環磷酸腺苷的表達。此外，使用濃度為20 μg/ml的臭氧效果優于10或30 μg/ml，鞘內給予20 μg/ml臭氧可逆轉慢性神經根炎大鼠脊髓磷酸二酯酶2A和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)/p65 mRNA蛋白表達水平升高的趨勢。因此，臭氧可能是抑制神經炎癥有效的治療手段。

通過建立大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebralartery occlusion, MCAO)模型并用臭氧(2 mg/kg)干預發現，臭氧可顯著提高MCAO大鼠的存活率，降低大鼠腦含水量及神經功能評分，控制缺血大鼠的腦梗死[12]。NF-κB在腦缺血時被激活，可導致MCAO大鼠神經炎性損傷和神經元凋亡，臭氧通過降低Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)、IκB激酶β(IKKβ)、IκB激酶α(IKKα)和NF-κB/P65的表達水平來抑制NF-κB信號通路，研究結果也提示，臭氧可通過抑制神經炎癥來治療腦卒中。

1.2 卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD) 是腦卒中的主要并發癥之一。研究表明，PSD可能對30%腦卒中患者的恢復產生影響。趙冬鳳等[13]對120例PSD患者實施臭氧自體血治療2周后，試驗組血清超敏C反應蛋白(hypersensitiveC-reactiveprotein，hs-CRP)水平及漢密爾頓抑郁量表(Hamilton depression scale, HAMD)評分均低于對照組，且hs-CRP水平與HAMD評分呈正相關。隨訪1個月后顯示，試驗組臨床療效優于對照組。表明臭氧治療可能通過降低患者hs-CRP水平，改善炎性反應對血管內皮的損傷，穩定機體的內環境，緩解抑郁癥狀，提示臭氧治療對早期PSD的治療有效。

1.3 多發性硬化癥(multiple sclerosis,MS) 是一種導致脫髓鞘和軸索損傷的CNS慢性炎癥性自身免疫性疾病，確切的病因尚不清楚[14]。調節性T細胞(regulatory T cells, Treg)頻率和功能障礙可導致炎癥和疾病進展，臭氧療法作為一種潛在的治療方法，可調節MS患者的免疫系統反應和炎癥反應。Tahmasebi等[15]通過臭氧自血療法治療20例復發緩解型MS患者，為期6個月。與治療前相比，臭氧治療后患者Treg細胞數量、叉狀頭/翅膀螺旋轉錄因子(Foxp3)、miRNAs(miR-17和miR-27)、IL-10和轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)表達水平均顯著升高，顯著降低了患者miR-146a的表達水平。并且臭氧治療提高了MS患者Treg細胞的頻率及其相關因素。因此，臭氧治療對MS患者有益。此外，Delgado-Roche等[16]通過臭氧直腸吹入治療28例復發緩解型MS患者，發現臭氧可減少促炎細胞因子TNF-α和IL-1β水平，增加MS患者單核細胞中蛋白激酶CK2的表達和核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor2, Nrf2)的磷酸化，提示臭氧的抗炎作用可能與Nrf2磷酸化和活化的誘導部分相關，臭氧療法是MS患者的潛在治療選擇。

2 對神經系統的抗氧化應激作用

神經系統疾病的致病因素大都涉及到氧化應激，如自由基增多和脂質過氧化物的聚集等。活性氧(reactive oxygen species,ROS)與神經元損傷和神經傳遞異常有一定關系[17]。研究表明，臭氧可促進氧化預處理，可通過增強內源性抗氧化劑的產生、改善局部血液循環和調節免疫反應來逆轉慢性氧化應激[18]。

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是發生于老年人的CNS變性性疾病，其特征性運動功能障礙是由黑質中多巴胺(DA)神經元的喪失和紋狀體DA的消耗引起的[19]。在6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)誘導的小鼠PD模型中，鄧兵梅等[20]發現，連續直腸吹入5 ml臭氧 15 d，對6-OHDA誘導的大鼠中腦黑質區腦組織氧化損傷具有保護效應，使黑質部位谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性升高，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量降低。提示臭氧可能是一種有效的治療PD的方式。

基于快速眼球運動睡眠剝奪模型，稅云華等[21]使用濃度為30 μg/ml的臭氧與2 ml大鼠尾靜脈血按1∶1混合3～5 min后從尾靜脈輸回體內(1次/12 h，共3 d)，干預72 h時發現，臭氧組大鼠覺醒期減少，慢波睡眠、快波睡眠及血清褪黑素水平增加，且大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平、MDA水平降低，GSH-px水平增高，表明臭氧對于調節睡眠剝奪大鼠睡眠時相、降低體內氧化應激水平具有積極意義。

Karademir等[22]探討了腹腔注射臭氧聯合胰島素對糖尿病大鼠顱脊髓神經病變的治療作用。大鼠誘導糖尿病后，測定總氧化狀態(total oxidation state,TOS)和總抗氧化狀態(total antioxidant state,TAS)，計算氧化應激指數(oxidative stress index,OSI)，取腦組織和脊髓組織進行組織病理學檢查。結果顯示，臭氧組、胰島素組及臭氧聯合胰島素組與對照組相比，TAS較高、TOS和OSI較低、軸突退變和血管充血的病理改變較小。這表明臭氧結合胰島素可刺激糖尿病神經病變的內源性抗氧化防御機制，從而預防ROS誘導的損傷，對顱脊髓神經病變有保護作用。

3 對神經系統的抗細胞凋亡作用

大量研究表明，退行性變疾病與細胞過度凋亡密切相關，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)在細胞凋亡中起關鍵作用[23-25]。

Cai等[23]通過構建神經元SH-SY5Y細胞缺血-再灌注損傷(ischemiareperfusion injury,IRI)模型并進行臭氧預處理發現，臭氧通過增加GSH-Px、SOD、過氧化氫酶(catalase,CAT)和減少MDA來減輕氧化損傷。臭氧降低了SH-SY5Y細胞IRI引起的線粒體損傷，抑制了細胞色素C從線粒體向細胞質的釋放，并且通過增加SH-SY5Y細胞中凋亡相關基因Bcl-2/Bax比值和抑制caspase信號通路來減少細胞凋亡。表明臭氧具有維持氧化還原穩態、減輕線粒體損傷、抑制神經細胞凋亡的作用。Wu等[24]建立了化學神經根神經炎大鼠模型并給予1 mg/(kg·d)臭氧治療。發現臭氧顯著減少了模型大鼠中自噬體的形成，抑制了神經根細胞的自噬。與模型組相比，臭氧顯著降低了自噬標志因子LC3B的水平和裂解的caspase3的表達，緩解了神經根細胞的凋亡，抑制了LC3B和自噬相關基因Beclin1的表達。

臭氧治療對新生大鼠缺氧缺血腦損傷(hypoxia-ischemia brain injury,HIBI)有一定影響。文獻[25]對7日齡雄性Wistar大鼠，隨機分為假手術組、對照組、臭氧處理組(分為低劑量組1 mg/kg和高劑量組2 mg/kg)。除假手術組外，其余大鼠均置于缺氧室中，結果表明臭氧治療組大鼠右半球凋亡神經元數明顯少于對照組，且臭氧高劑量組凋亡神經元數更少。臭氧高劑量組Morris水迷宮試驗結果與假手術組相似。研究結果提示，臭氧治療可以降低HIBI新生兒大鼠的神經元凋亡，改善了認知功能，表明臭氧可以通過抑制細胞凋亡來延緩神經系統疾病的進展。

4 保護神經及促進神經再生作用

4.1 肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS) 是一種無法治愈的致命神經退行性疾病，其中進行性運動神經元丟失和炎癥反應是主要的病理學標志[26]。目前用于研究ALS的動物模型，技術最成熟、應用最廣泛的是銅鋅超氧化物歧化酶-甘氨酸93丙氨酸(copper zinc superoxide dismutase 1-glycine to alanine mutation at position 93，SOD1-G93A)轉基因小鼠模型。Bette等[27]建立SOD1-G93A小鼠模型，研究了為期5d的臭氧腹腔注射治療方案的治療潛力。對SOD1-G93A小鼠的臨床評估顯示，在終末期SOD1-G93A小鼠的腦干中，臭氧治療可減慢神經退行性變，使三叉神經運動核中與SOD1相關的空泡化減少。此外，腦干中的小膠質細胞增殖不明顯，而星形膠質細胞的肥大基本上沒有受到影響。在SOD1-G93A小鼠出生后第60天，血液、脾臟和腸系膜淋巴結中的單核細胞數量減少。并且臭氧還可以減少疾病晚期SOD1-G93A小鼠的腸系膜淋巴結中的單核細胞數量。總的來說，該研究揭示了臭氧作為治療劑應用于ALS小鼠時，具有選擇性的神經保護和可能的抗炎能力以及潛在的治療能力。

4.2 神經干細胞(neural stem cells, NSCs) 臭氧在體外對NSCs也可產生影響。Costanzo等[28]研究了輕度臭氧化對人脂肪源成體干細胞(human adipose tissue derived adult stem cells,hADAS)的影響，通過組織化學、形態計量學和超微結構分析，表明低濃度臭氧可誘導hADAS細胞中的脂質生成，且不會產生有害影響，為未來闡明輕度臭氧化對脂肪組織的影響以實現組織再生和組織工程的研究鋪平了道路。Tricarico等[29]為深入了解臭氧對NSCs的作用機制，測試了臭氧對神經外胚層細胞(神經元前體和分化神經元)的影響，量化它們的增殖、遷移、細胞因子釋放和細胞存活，結果發現，臭氧會顯著影響細胞因子的釋放、細胞遷移的距離并導致細胞增殖的輕微變化，且低濃度臭氧增加細胞遷移的距離，為進一步研究臭氧在神經系統再生中的應用奠定了堅實的基礎。

總之，由于臭氧具有安全有效、價格低廉、操作簡便、感染等并發癥少和適用范圍廣等優點，近年來臭氧在國內外的研究和應用越來越廣，大量的實驗室研究提供了臭氧抗炎、抗氧化能力，以及血管、血液和免疫系統調節的證據[30, 31]。已有研究發現，臭氧對神經系統疾病起到治療作用，但其機制尚未明確，仍需進行更深入地研究，擴大臨床應用范圍。