miR-675 在2 型糖尿病合并非酒精性脂肪肝中的 研究進展

劉璐，景潔，王家浩，劉菊香，權金星(通信作者*)

(1.甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000)

0 引言

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一組由遺傳和環境因素引起的，導致胰島功能下降，胰島素敏感性逐漸惡化和胰腺胰島素分泌減少，形成相對胰島素缺乏的狀態，導致高血糖，以慢性高血糖為主要特征的代謝性疾病，嚴重降低了人類的生活質量，預計到 2030 年將影響到5.784 億人，成為全球最常見的致殘的慢性疾病之一[1]。非酒精性脂肪肝已經發展成為全世界最常見的慢性肝病[2]，據最新研究報道，T2DM 中NAFLD 的患病率為 54.3%-64.9%[3]。一份來自22 個國家的850萬人的最新研究表明，80%以上的人都是超重或者肥胖，72%的人有不正常的血脂，44%的人是2型糖尿病。非酒精性脂肪性肝病是一種與內臟脂肪和代謝綜合征密切相關的肝損傷類型[4]，其亞型主要有非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎，成為肝硬化、肝癌的主要病因。非酒精性脂肪肝和2 型糖尿病之間相互作用，兩者在病理生理機制上有密不可分的聯系[5]。糖尿病合并脂肪肝的發生與高血糖、胰島素抵抗和高脂血癥等密切相關[6]。糖尿病患者在長期的高血糖狀態下，血清中氧化應激產物及NF-κB、IL-6、IL-18 等炎癥介質增加，從而影響脂類物質在血液與肝臟之間的交換和代謝[7]，同時炎癥因子將炎癥細胞募集到肝臟并通過線粒體增加活性氧應激并促進細胞死亡[8]。MicroRNAs(miRNAs，miRs) 是 一 類 長 約20-25 個核苷酸的內源性非編碼小RNA，通過與靶基因的mRNA 的3’端非編碼區(3’UTR)結合，促進靶基因mRNA 的降解或抑制蛋白的合成，負性調控靶基因的表達[9]。miRNA 可以在細胞外被檢測到，包括在血液、尿液和其他體液中，它們的表達相對穩定[10]。越來越多的證據表明，miRNA 通過控制胰島細胞功能、脂肪細胞胰島素抵抗、肝細胞胰島素信號、葡萄糖穩態，在調節葡萄糖和脂代謝中發揮作用，因此可能參與相關疾病的發病機制[11]。

1 目前非酒精性脂肪肝的診斷

非酒精性脂肪肝是一種異質性疾病，從組織學的角度可以分為非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。非酒精性脂肪肝是指有至少5%的肝臟脂肪變性，且沒有肝細胞氣球樣變的跡象。非酒精性脂肪肝是指有至少5%的肝臟脂肪變性，伴或者不伴纖維化。從流行病學觀點來看，NAFLD 中晚期階段心血管的代謝危險升高，例如中晚期NASH 伴纖維化[12,13]。因此改進現有的診斷方法，并進一步發展具有創新性的、非侵入性工具來診斷這些不同階段的疾病，是非常必要的。

臨床實踐中對于肝臟脂肪變性的診斷，超聲的應用是非常廣泛的，整體敏感性85%，特異94%，精確度較高[14]。但是和磁共振質子波普成像相比，肝臟超聲檢測肝臟脂肪變性的能力較差[15]，只有當肝臟脂肪含量達到至少12.5%時，肝臟超聲才會有其高敏感度，約為80-85%[16]。磁共振質子波普成像價格高昂，較少用于臨床。目前應用的肝臟脂肪變性的診斷指標中，廣泛應用的脂肪肝指數的靈敏度為73%，特異度為74%[17]。計算機斷層成像技術(CT)對于脂肪肝的診斷是非常精準的，但是由于射線的量比較大，較少應用于臨床。目前采用各種非侵入性手段診斷非酒精性脂肪肝的關鍵是確定是否存在脂肪性肝炎，特別是中重度纖維化(至少F2 纖維化階段)來衡量疾病的嚴重程度。血漿谷丙轉氨酶(ALT)濃度升高并不能準確預測疾病的嚴重程度，即使血漿谷丙轉氨酶濃度是正常上限的兩倍(＞70 U/L)，也只能預測NASH，其敏感性為50%，特異性為61%[18]。所以，在評價肝臟疾病的本質和嚴重性方面，肝組織切片活檢仍是最明確的檢測方法。但是，由于組織切片的費用和可能出現的并發癥，使人們對開發一種新的、無創的治療方式產生了濃厚的興趣[19]。

2 miR-675 參與NAFLD 的發生發展

2.1 miR-675 是由H19 的第一個外顯子產生的，H19 是一種長鏈非編碼RNA[20]，國內外研究發現，miR-675 在口腔癌[21]、乳腺癌[22]、胰腺導管細胞癌[23]、肝細胞癌[24]等惡性腫瘤中細胞中表達上調，通過多種途徑參與腫瘤細胞的增殖與侵襲。高糖狀態下，應用Targetscan 生物信息軟件預測miR-675 的靶基因，進而用DAVID KEGG 分析，發現對預測的靶基因進行分類，從而識別miR-675 參與的通路，發現miR-675 參與了胰島素信號通路、脂肪因子信號通路等[25]。VDR 是miR-675 的靶基因之一，H19/miR675/VDR/EGR1 的負反饋回路參與了DN 的發展[26]。

2.2 內臟脂肪組織的積累與代謝綜合征風險增加相關，肝臟在調節脂質代謝和內穩態方面起著核心作用，而脂質代謝和胰島素信號的破壞與NAFLD 密切相關。因此，確定控制脂質代謝和胰島素抵抗的調控因子是至關重要的。心包脂肪沉積在心臟周圍的兩個位置:心外膜(EAT)和心旁脂肪組織，已被證實心外膜脂肪沉積與胰島素抵抗、中心性肥胖存在正相關關系[27]，在該研究中miR-675 在高血糖期間在EAT 中顯著上調[25]。高血糖狀態下miR-675 的靶基因預測表明PCK-2 是miR-675 的靶點。PCK-2 編碼了線粒體同工酶，與甘油發生有關，通過脂肪組織中的甘油三酯-脂肪酸循環影響脂肪酸的儲存和調節釋放。[28]甘油發生是糖異生的一種簡化形式，即從丙酮酸、乳酸或丙氨酸等底物中產生甘油-3-磷酸，甘油生成在脂肪組織和肝臟中很重要，以維持甘油三酯-脂肪酸循環。甘油異生，像糖異生一樣，是由PCK 活性調節的[29]。PCK 參與肝臟、脂肪組織甘油三酯的儲存，可能在脂質儲存調節中發揮重要作用。同時，有研究證實，小鼠肝臟過表達PCK-2 會導致胰島素抵抗和2 型糖尿病[30]。

2.3 miR-675 參與人間充質干細胞脂肪形成過程中脂滴形成[31]，該研究通過RNA 分離和RNASeq分析篩選了95 種與脂滴形成的相關的miRNA，測定了人間充質干細胞7d、14d、21d、28d 的miRNA 水平的變化,發現miR-675 顯著差異性上調，并用TargetScan 軟件預測了其靶基因，主要靶向ACSL1( 長鏈脂酰COA 合成酶)、APOB( 載脂蛋白)、METTL7A( 甲基轉移酶樣蛋白7A)、PLIN1(人圍脂滴蛋白1)和PLIN4(人圍脂滴蛋白4)等，可能成為代謝綜合征(如肥胖癥、2 型糖尿病、脂肪變性、動脈粥樣硬化和骨質疏松癥)的生物標志物和治療靶點。

2.4 NAFLD 的發病機制目前尚不清楚，遺傳和環境均有影響，可以用“二次打擊”假說解釋，胰島素抵抗始終是關鍵，第二次打擊時，肝臟內過多的游離脂肪酸在線粒體內代謝時，產生大量氧活性自由基，氧化肝臟內的脂質成為脂質過氧化物。而氧自由基和游離脂肪酸同時也是動脈粥樣硬化的高危因素[32]。miR-675 與超敏C 反應蛋白(CRP)在動脈粥樣硬化患者中同時高表達，miR-675 成為動脈粥樣硬化的重要預后標志物[33]。有文獻報道，對動脈粥樣硬化糖尿病大鼠的髂主動脈組織樣本中鑒定728 種miRNA，其中的9 種miRNA 顯著差異上調，包括miR675[34]。

2.5 miR-675 的前體長鏈非編碼基因H19，通過miR-675/IGF-1 信號通路參與調控肝臟的發育成熟[20]。雖然凋亡和壞死都導致細胞死亡，但兩者對周圍組織微環境和隨后的免疫反應的影響有明顯不同[35,36]。與細胞凋亡不同，壞死是高度炎癥性的，在該研究中發現miR-675 和H19 在肝硬化肝臟中升高，miR-675 靶向FADD 下調，增強了炎癥信號下的肝臟壞死性凋亡，這種調節刺激和增強了肝臟的炎癥反應[37]，已有研究表明，H19能增強NF-κB 的活化，從而促進細胞的存活和增殖[38]。該研究我們證明了H19 的這個功能至少可以部分歸因于miR-675 的活性，通過miR-675處理后可增強體內幾個NF-κB 靶基因的表達，特別是促炎細胞因子。該研究發現在注射了miR-675 的小鼠的肝臟中看到了巨噬細胞的募集。以上結果強烈表明，miR-675 通過增加 NF-κB 的激活來增強肝臟炎癥。

2.6 lncRNAs 和miRNAs 均 參 與 調 節 了HBV 相關肝病[39], 劉青[40]等將HBx 轉染到L02 細胞中后ALT、AST 升高從而構建肝細胞損傷模型，lncRNAH19 和miR-675 的表達顯著上調，從而說明lncRNAH19 和miR-675 軸參與了HBV 相關的肝炎和肝細胞損傷。免疫反應因子，特別是促炎細胞因子，在HBV 誘導的肝損傷中發揮重要作用[41]。在本研究中，我們發現HBx 過表達顯著提高了IFN-γ、IL-6 和IL-18 的產生，而抑制lncRNAH19 或miR-675 明顯抑制了其升高，所以表明lncRNAH19/miR-675 軸調控了HBx 誘導的炎癥因子。為了進一步研究H19/miR-675 軸在HBx 誘導的細胞損傷中的潛在分子機制，我們使用Miranda 和TargetScan 預測了miR-675 假定的靶基因，最終篩選PPARα 作為研究重點，該研究在隨后的雙熒光素酶報告證明miR-675 直接靶向PPARαmRNA 的3'-UTR。該研究對此進行了驗證，在慢性乙型肝炎患者組織中PPARα 的表達顯著下調，且lncRNA H19 的表達與PPARα或miR-675 與PPARα 呈負相關。這些結果提示H19/miR-675/PPARα 軸可能在慢性乙型肝炎中發揮重要作用。隨后該研究又進一步證實了LncRNA H19/miR-675 /PPARα 軸通過Akt/mTOR信號調控乙型肝炎蛋白誘導的肝細胞損傷和能量代謝重塑。

3 小結

綜上所述：miR-675 可能在2 型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的病理發生機制具有重要作用，miR-675 是一種具有潛力的新的治療靶標，它可以從多個角度、多途徑參與 NAFLD 的發病機理，從而為 NAFLD 的治療提供新的方法和方法。但在此基礎上，仍然存在著許多需要進一步解決的問題。比如，在動物試驗中非常有效的miR-675 是否也能在人類身上產生同樣的作用？是否可以在臨床上推廣？它是怎樣在臨床上使用的？miR-675 的研究是一個充滿了未知與驚奇的過程，它的作用靶標和機理有待于進一步的深入探討。