腫瘤細胞來源的外泌體在腫瘤微環境中的調控作用及其與腫瘤相關巨噬細胞的關系

裴文浩，王文銳，楊清玲，陳昌杰*

（1.蚌埠醫學院癌癥轉化醫學安徽省重點實驗室，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫學院生物化學與分子生物學教研室）

腫瘤的惡性表型是由癌細胞及其周圍的腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）共同決定的［1］。除腫瘤細胞外，TME還含有多種基質細胞，包括成纖維細胞、淋巴細胞、炎癥細胞、內皮細胞和間充質干細胞［2］。這些細胞總是與腫瘤細胞一起進化。TME中的細胞通訊對腫瘤的發生發展以及侵襲、轉移等惡行生物學行為有重要影響［3］。然而，腫瘤細胞通訊的分子機制尚未完全闡明。

先前的研究主要集中在腫瘤細胞和免疫細胞之間通過直接接觸和分泌信號分子，如可溶性細胞因子和趨化因子的異型相互作用［4］。外泌體的發現為腫瘤免疫的深入研究提供了新的視野。與對照組的癌旁組織或正常組織相比，腫瘤相關巨噬 細 胞 （tumor-associated macrophages，TAMs）在大多數人類腫瘤組織中都表現出更強的浸潤性［5］，這說明TAMs在腫瘤的發生發展中起到重要的作用。研究表明，TAMs與多種細胞類型相互作用，重新編程并誘導巨噬細胞極化［6］。TAMs失去殺傷能力，隨后獲得一種抑制表型，從而促進腫瘤的發展，腫瘤細胞來源的外泌體在這一過程中通常起著重要作用。同時TAMs會釋放促進腫瘤發展的外泌體。本文將綜述外泌體在腫瘤細胞與TAMs通訊中起到的作用，以及外泌體在靶向治療中潛在的作用。

1 TME

TME是一個由惡性腫瘤細胞、腫瘤浸潤免疫細胞、內皮細胞、膠質細胞、腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）以及這些細胞分泌的細胞因子和趨化因子組成的獨特體系［7］。非腫瘤細胞主要包括血管內皮細胞、淋巴管內皮細胞、固有免疫細胞（TAMs、DCs、NK細胞等）、獲得性免疫細胞（T和B淋巴細胞）和各種間質細胞［8］。TME中各種細胞相互作用且彼此影響，其代謝產物不僅是能量供應的來源，同時也介導了TME中各種細胞之間的信息傳遞。一方面，惡性腫瘤細胞可利用其代謝產物改變腫瘤浸潤性免疫細胞的代謝模式，誘導其發揮免疫抑制功能，并進一步從外周招募免疫抑制性細胞進入腫瘤組織。例如，惡性腫瘤細胞通過糖酵解生成乳酸，導致TME酸化，從而抑制免疫系統的腫瘤識別能力和抗腫瘤反應［9］。另一方面，腫瘤浸潤免疫細胞的代謝產物也可促進腫瘤發展。例如，TAMs可分泌腎上腺髓質素（ADM）促進腫瘤新生血管生成，從而促進黑色素瘤的生長［10］。綜上所述，TME中的惡性腫瘤細胞和免疫細胞之間相互作用，協同促進腫瘤的發展。

2 外泌體

外泌體是直徑在30～150 nm的細胞外小泡，具有核內體來源，根據細胞來源不同，外泌體含有多種細胞成分，包括DNA（線粒體和基因組）、脂質（膜）、蛋白質、轉座子和RNA（編碼RNA及非編碼RNA）［11］。當內體成熟時，這些物質轉化為多囊泡體（MVB），并運輸到質膜，然后以外體的形式釋放出細胞。目前，已有研究證實MVB的分選機制有助于用特定的蛋白質和RNA分子選擇性地富集外泌體。這些機制表明，分子分選到外泌體是一個受調控的過程，而不是像病理過程一樣［12］。

蛋白質外泌體的分選有翻譯后修飾的參與，如泛素化負責分離主要組織相容性復合體Ⅱ（MHC-Ⅱ）［13］和致癌蛋白表皮生長因子受體（EGFR）［14］。此外，RNA誘導沉默復合體（RISC）蛋白，包括AGO2、GW182［15］和包含有 GAGG 序列的 RNA結合蛋白（RBPs）［16］已被證實是分離特定RNA到外泌體中的必須物質。外泌體通過受體介導的內吞、胞飲、吞噬作用或者是與細胞膜的融合被受體細胞內化，導致其內容物直接釋放到細胞質中，外泌體傳遞分子信號可以改變受體細胞的功能和表型。外泌體中特定的細胞成分靶向積累表明他們在調節細胞通訊方面起著至關重要的作用［17］。

外泌體通過調節TME參與腫瘤的發生和發展。在腫瘤細胞和TAMs之間同樣也存在著外泌體介導的細胞與細胞間的通訊，它可以調節腫瘤細胞的生物學特性，從而影響TAMs的極化，進而促進或阻礙腫瘤的發展［18］。外泌體的功能主要取決于其來源和含量［19］。另外，還有研究表明外泌體誘導的細胞通訊是專門用于遠距離相互作用的［20］，促進蛋白和后續在靶細胞中表達的功能性mRNA和miRNAs的轉移［21］。因此，深入了解外泌體調控TAMs和腫瘤細胞之間通訊的分子機制，可能會有助于開發新的逆轉腫瘤抑制免疫反應的抗腫瘤治療方案。

3 TAMs

3.1 TAMs的形成 TAMs是腫瘤微環境細胞的一個亞群，來源于骨髓中的單核細胞，在實體瘤中影響腫瘤的進展［22］。Cortez-Retamozo 等［23］研究發現，脾臟中的CD11b（+）Ly-6C（hi）單核細胞是TAMs的另一個來源。研究表明，腫瘤源性趨化因 子 配 體 （CCL2、 CCL3、 CCL4、 CCL5、CCL7、CCL8、CXCL12）、血小板衍生生長因子（PDGF）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、血管內皮生長因子（VEGF）和白介素10（IL-10）等使單核細胞在TME中聚集，分化成的TAMs通過產生細胞因子、生長因子、趨化因子和細胞外小泡等參與腫瘤的發展［24］。

3.2 TAMs表型及功能特性 TME中的巨噬細胞即為TAMs，因所處環境的差異而有不同的分化，具有高度的可塑性［15］。Laviron 等［25］認為 TAMs至少被活化成兩個亞型，即M1型（傳統激活）和M2型（替代激活），它們在腫瘤中發揮的作用幾乎相反（抗腫瘤/促進炎癥和促腫瘤/抑炎癥）。

3.2.1 M1型TAMs 在宿主體內，經典激活的M1型巨噬細胞通常會受到感染或組織損傷的刺激，并且還可以通過細菌配體（如脂多糖）或細胞因子（如干擾素γ）在體外被激活，M1型巨噬細胞具有促炎特性，并且分泌細胞因子，如白介素1（IL-1）、IL-6、IL-12和腫瘤壞死因子α（TNF-α）［25］。此外，這些細胞會分泌一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）［26］。M1型巨噬細胞分泌的細胞因子除了能防御病原體入侵還能夠刺激其他免疫細胞，如輔助T細胞1和17（Th1、Th17）以及自然殺傷細胞（NK）［27］。典型激活的M1巨噬細胞產生的ROS與氮物種和促炎細胞因子的能力是防御病原體和抗腫瘤的關鍵，這讓M1巨噬細胞成為“好巨噬細胞”［28］。

3.2.2 M2型TAMs 巨噬細胞被一系列刺激因子（IL-4、IL-10、IL-13）以及Toll樣受體和IL-1受體的配體交替激活，導致表型分化為抗炎M2巨噬細胞［27］。這些細胞通過產生IL-10、CCL18、CCL22和降低IL-12的分泌發揮其抗炎作用［29］。由于他們在腫瘤進展和侵襲中的作用，他們被認為是“壞巨噬細胞”［30］。

4 腫瘤來源的外泌體調節巨噬細胞極化

腫瘤來源的外泌體在免疫調節中也起著至關重要的作用。研究表明，外泌體可以重塑腫瘤免疫微環境，有利于腫瘤的促進狀態，支持腫瘤的發生、侵襲、血管生成、轉移前的生態位形成和轉移擴散［31］。基于不同的分子組成，外泌體可以將巨噬細胞轉換為M1或M2表型［32］。

4.1 miRNAs miRNAs是一種小的、非編碼RNA，長度通常為20～25個核苷酸，通過與特定的mRNA序列結合，抑制靶基因的翻譯［33］。腫瘤來源外泌體最顯著的特征之一是由多個miRNAs組成，成熟的miRNAs占所有RNA的41.7%［34］。多個miRNAs被認為是外泌體的關鍵生物活性成分。外泌體miRNAs可通過影響巨噬細胞表型、細胞因子分泌、T細胞相關免疫耗竭和缺氧微環境來調節TAMs功能。

越來越多的證據表明，外泌體miRNAs通過調節靶分子在TAMs的浸潤和極化過程中發揮重要的生理功能。Zhao等［35］在結直腸癌（CRC）肝轉移組織中發現，miR-934在CD163+TAM浸潤豐富的區域表達升高；此外，外泌體miR-934通過下調PTEN表達和激活PI3K/AKT信號通路而誘導M2巨噬細胞極化。許多重要的轉錄因子，如PPAR、STAT3和STAT6參與了TME中巨噬細胞的極化。Ying等［36］研究表明，上皮性卵巢癌（EOC）來源的外泌體miR-222-3p誘導了TAM樣巨噬細胞表型，并通過SOCS3/STAT3途徑極化為M2表型。此外，當CXCL12/CXCR4軸激活時，CRC細胞來源的外泌體miRNAs，miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p，通過抑制共同的靶基因PTEN和激活PI3K/AKT通路而誘導M2極化的巨噬細胞表型［37］。

外泌體影響巨噬細胞極化，并影響巨噬細胞與其他免疫細胞，特別是參與調節腫瘤免疫微環境的T細胞之間的相互作用。內質網應激誘導肝癌細胞釋放外泌體miR-23a-3p，通過激活Stat3信號通路上調巨噬細胞PD-L1的表達，減弱抗肝癌免疫反應［38］。來自癌細胞的外泌體miR-21和miR-29a觸發人和小鼠TLR8介導的核因子-κB（NF-κB）在巨噬細胞中產生IL-6和IL-6［39］。在TME中，低氧腫瘤細胞與免疫細胞廣泛溝通，為癌細胞免疫逃逸創造有利條件。有研究表明，缺氧促進外泌體分泌，導致癌細胞的侵襲性表型和血管生成［40］。大量研究表明，缺氧誘導的腫瘤外泌體含有各種非編碼RNA，特別是參與腫瘤進展的miRNAs。這些外泌體還促進M2巨噬細胞極化和miRNAs介導的巨噬細胞代謝轉變。Chen等［41］證明了卵巢上皮癌低氧環境中的外泌體富含miR-21-3p、miR-125b-5p、miR-181-3p，這些miRNAs被原始巨噬細胞內吞，并通過激活SOCS4/5/STAT3/HIF1通路促進TAMs極化。缺氧通過激活許多轉錄因子，如Snail和Twist，為上皮-間充質轉化（EMT）的進展創造了一個不可或缺的環境［42］。在Snail過表達的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞中，Snail可以通過直接結合的方式增強miR-21的表達，之后包裝在外泌體中，在被巨噬細胞吞噬后，外泌體miR-21下調PDCD4和IL-12a的表達并介導M2極化［43］。綜上所述，腫瘤細胞來源的外泌體miRNAs對TME中的TAM極化有關鍵影響。這些miRNAs可以用作腫瘤生物標記物來監測腫瘤進展，也可以用作重要的藥物設計靶點或藥物載體［44］。

4.2 LncRNAs LncRNAs為長度超過200個核苷酸，但不編碼蛋白質的RNA。據報道，LncRNA TUC339在肝癌來源的外泌體中高表達，其可以在肝癌細胞間相互轉移，促進腫瘤生長和轉移，此外，外泌體LncRNA TUC339可轉移到鄰近巨噬細胞，誘導巨噬細胞極化為M2表型，從而抑制抗腫瘤免疫應答［45］。來源于乳腺癌細胞的外泌體lncRNA BCRT1被巨噬細胞內化以促進M2極化，增強癌細胞的遷移和趨化能力，加速乳腺癌的進展［46］。

許多位于細胞質中的LncRNAs作為競爭的內源性RNA（CeRNA）海綿來調節miRNAs的表達和生物學功能，并參與腫瘤的進展。細胞質中的LncRNAs可以被分選為外泌體并被TAMs吸收，但它們是否通過海綿吸附來調節TAMs極化還有待進一步研究。此外，在癌細胞衍生的外泌體中也發現了其他非編碼RNA，如環狀RNA（CircRNAs）［47］。這些外泌體CircRNAs可以影響TME中的細胞通訊。肝癌來源的胞外體CircUHRF1通過靶向miR-449c-5p/Tim-3誘導NK細胞耗竭，從而導致對抗PD-L1治療的抵抗［48］。外泌體CircRNAs是否影響巨噬細胞極化還有待研究。

4.3 蛋白質 除了RNA，質膜蛋白還通過胞外結構域脫落和微囊釋放選擇性地進入細胞外空間。與以質膜出芽方式所釋放的囊泡不同，外泌體通過內吞途徑在多囊體中產生，然后當這些胞體與質膜融合時被移除［49］。Peinado等［50］已經確定了黑色素瘤細胞通過外泌體運輸的一種癌蛋白，即受體酪氨酸激酶MET，它會引發長距離炎癥，從化學反應上吸引循環中的癌細胞。包裝成外泌體的腫瘤相關蛋白可以在外泌體中被受體細胞攝取后保持其活性，有研究表明，腫瘤來源的外泌體蛋白改變了單核細胞來源的巨噬細胞的表型，Liang等［51］發現核糖核酸酶PRNA組分H1（RPPH1）與β-IIItubulin（TUBB3）結合，以阻止其泛素化，然后誘導子宮內膜樣變促進轉移，此外，RPPH1通過外泌體轉移到巨噬細胞，介導巨噬細胞M2極化。經大腸癌細胞來源的外泌體處理后，單核細胞來源的巨噬細胞表現為CD206 high/HLA-DR low表型，M2細胞形態伸展和拉長。同樣，Ham等［52］發現IL-6受體gp130存在于乳腺癌細胞來源的外泌體中，可刺激骨髓來源的巨噬細胞（BMDM）中的IL6/STAT3信號激活，磷酸化的STAT3轉位到細胞核，誘導靶基因的轉錄，包括巨噬細胞極化相關基因、IL-6、IL-10、CXCR4和CCL2，這種激活促進了BMDM的存活，并誘導BMDM向促癌表型轉變。與外泌體RNA的研究相比，巨噬細胞和TME中外泌體蛋白的功能和機制還需要進一步的研究來闡明。

4.4 脂質 在外泌體中已經發現了一些融合膜脂，它們在外泌體與質膜的融合中起著至關重要的作用。花生四烯酸（AA）是產生促炎脂質介質的主要多不飽和脂肪酸前體，其通過將緊密結合的脂質雙層轉化為六角形結構來促進膜聯蛋白2介導的膜融合，從而破壞膜的穩定性［53］。胰腺癌細胞ASPC-1來源的外泌體比受體細胞含有更高的AA水平，有利于其與THP-1來源的巨噬細胞融合，AA可增加前PGE2的分泌，增加M2表型的表達水平，并增強促進腫瘤進展的血管內皮生長因子、MCP-1、IL-6、IL-1β、MMP-9和TNF-α等生物活性分子的分泌［54］。

現有的研究集中在外泌體對巨噬細胞極化進入M1或M2型狀態的影響。然而，這種二分法遠遠不足以解釋TAMs的復雜性，因為極化在TME中是一個動態和可逆的過程，因此，需要進一步的研究來理解外泌體如何決定巨噬細胞向不同表型極化。有必要建立模型系統來研究不同亞型的巨噬細胞，尋找更準確的分子標志物來表征TAMs。同樣需要指出的是，內吞作用被認為是外泌體將其內容物運送到TAMs的主要機制。這一過程是否在TAMs的極化過程中起作用，是否與內吞作用不同，值得進一步研究。

5 巨噬細胞衍生外泌體與腫瘤進展

大多數TAMs缺乏吞噬腫瘤細胞的能力，而促進腫瘤細胞逃逸，使其能夠轉移到遠處組織。TAMs和癌細胞之間相互的外泌體交換也調節癌癥的進展。

5.1 調控腫瘤的增殖、遷移和侵襲 越來越多的證據表明，TAMs衍生的外泌體在促進癌癥發生和發展中起著重要作用。Zheng等［55］的研究發現，M2巨噬細胞衍生外泌體中的一種特殊蛋白ApoE介導了受體GC細胞中ApoE激活的PI3K/AKT通路的細胞間轉移，并增強了轉移潛能。這些結果突顯了巨噬細胞外泌體在腫瘤進展過程中TAMs與腫瘤細胞之間的相互作用中的重要性。

5.2 促進血管生成 腫瘤的生長和轉移在很大程度上依賴于血管生成。有研究表明，腫瘤組織中TAMs浸潤的數量與腫瘤血管密度密切相關［56］。在缺氧區，特別是在壞死組織中發現了大量的TAMs聚集體，TAMs可以釋放促進腫瘤發展的細胞因子，如IL-1β、血管內皮生長因子、TNF-α等細胞因子，El-Arabey等［57］的研究發現，轉錄因子GATA3從TAMs來源的外泌體中大量釋放，在TAMs與突變型TP53表達的高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）之間的相互作用中發揮關鍵作用，通過表觀遺傳調控促進血管生成和子宮內膜異位癥。同樣，M2巨噬細胞來源的外泌體miR-501-3p通過增加胰腺導管癌細胞血管生成相關蛋白VEGF-1-3p的表達而增強其管狀形成能力［58］。

5.3 產生抗藥性 藥物治療是控制腫瘤進展的主要治療策略。然而，耐藥性是實施此類療法的一個重大障礙。有研究表明，腫瘤細胞和間質細胞都可以分泌含有耐藥相關因子的外泌體，并將它們轉移到TME進行相互作用，從而增加耐藥性［59］。

5.4 對腫瘤新陳代謝進行重新編程 代謝重編程是惡性腫瘤的一個標志，Warburg等［60］發現，即使在氧氣充足的情況下，癌細胞的糖酵解速率也遠遠高于氧化磷酸化（OXPHOS），這就是所謂的沃伯格效應（Warburg Effect）。此后，一系列研究表明，除葡萄糖外，參與葡萄糖、氨基酸和脂類代謝途徑的異常代謝物也可誘導腫瘤相關代謝重編程，從而催生了免疫代謝研究領域［61］。這些分子代謝物通過胞外途徑轉移到TME中，影響受體細胞的新陳代謝，有利于腫瘤的進展。Wang等［62］的研究表明，輻射后肺癌細胞的外泌體中含有代謝酶ALDOA和ALDH3A1，通過加速糖酵解來增強非輻射肺癌細胞的遷移和侵襲能力。一項研究表明，HIF-1α穩定的長非編碼RNA（HISLA）是一種被細胞外囊泡（EV）包裝的lncRNA，通過EV從TAMs傳遞到腫瘤細胞，增強了乳腺癌細胞的有氧糖酵解和抗凋亡能力；機制上，HISLA與PHD2相互作用，抑制HIF-1α的羥基化和降解；此外，腫瘤細胞釋放的乳酸上調巨噬細胞中的HISLA，在TAMs和腫瘤細胞之間形成一個前饋環路。這些結果表明，外泌體轉移對于TME中多種細胞類型之間的細胞通訊是一種有用的方法。除了糖酵解，腫瘤代謝重編程還包括脂質、氨基酸和三羧酸循環代謝。外泌體也可能參與這些代謝過程［63］。CAFs分泌外泌體miR-522，通過靶向花生四烯酸脂氧合酶15（ALOX15）和阻斷脂質-ROS的積累來抑制GC細胞中的鐵死亡，從而支持腫瘤的進展和耐藥性［59］。然而，TAMs衍生的外泌體是否參與這些過程尚不清楚，需要深入研究。

6 小結與展望

腫瘤細胞來源的外泌體可以通過運輸生物活性物質反映出癌癥的階段，這使得外泌體可以作為診斷和預測臨床預后的潛在標志物。TAMs是TME的重要組成成分，TME中各種信號通路和細胞影響TAMs的分化，其生物特性使其成為免疫治療藥物開發的重要靶點，通過深入研究癌癥分子生物學，分子藥物靶向治療腫瘤取得突破性的進展。本文就TME中組成成分以及外泌體如何影響TAMs極化的表型、作用機制及其在結直腸癌治療和預后中的潛在應用進行了綜述。TME中的相關細胞分泌多種腫瘤相關的細胞因子形成利于腫瘤發展的環境，同時募集TAMs、促進TAMs極化為M2型巨噬細胞。在這些因素中，腫瘤細胞來源的外泌體所包含的miRNAs在促進巨噬細胞極化中起到了不可忽視的作用。與此同時TAMs的分泌產物也促進著腫瘤的發展，二者之間形成利于腫瘤發展的正反饋調節，這提示，可以將抑制TAMs的形成過程作為免疫治療的靶點，或是探尋合適的分子標志物以此評價患者的預后情況。外泌體在促進TAMs形成中起到無法忽視的作用，這也為外泌體成為體外檢測標志物提供了有力依據，對此有必要進一步深入研究外泌體的獨特生物活性。因為除了對M1和M2巨噬細胞極化的影響之外，外泌體是否還參與了巨噬細胞其他表型的極化作用，或者某些特定的巨噬細胞亞群是否分泌了可以調節TME的獨特的外泌體？這些仍然值得深入探討，以期為找尋免疫治療的靶點提供新的思路。之后我們會進行一系列的體外實驗來證明外泌體對TAMs極化的影響并且希望能夠闡明外泌體中的miRNAs是如何調節腫瘤的發生發展的。