奇壬醇對骨質疏松癥的治療作用及機制研究進展

昌 震，李大同，楊小彬，孔令擘，孫 楊

(1.西安交通大學附屬紅會醫院脊柱外科，陜西 西安 710054；2.漢中職業技術學院附屬醫院骨顯微外科，陜西 漢中 723000)

現代研究表明，許多中草藥具有放松關節、強化骨骼和肌肉的功能，并可用于治療骨損傷的相關疾病，如骨質疏松癥。天然植物或藥物可以通過調節骨特異性基質蛋白、轉錄因子、細胞因子、信號通路、骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)與核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)受體活化因子受體配體(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)系統(即OPG-RANKL系統)和激素類生物活性物質的表達來促進成骨細胞的增殖與分化。奇壬醇(Kirenol，Kir)是一種天然單體，在一些實驗中顯示其對破骨細胞的分化有著抑制作用，為骨質疏松癥的治療提供了新的前瞻性思路。現就奇壬醇對骨質疏松癥的治療作用及機制進行綜述。

1 骨質疏松癥概述

骨質疏松癥是常見的骨科疾病，其特點是骨量減少與骨組織微結構的退化，極大地增加了骨折的風險。脊柱骨折不僅顯著影響患者的生活質量，增加社會醫療負擔，并且護理不當也會導致病死率的增加。事實上，由于壽命延長和人口老齡化加劇，骨質疏松性骨折的發病率在男性與女性人群中明顯增高[1]。骨質疏松癥主要分為原發性和繼發性，包括絕經后由于雌激素水平下降導致的骨質疏松(即絕經后骨質疏松癥)。其次是繼發性疾病引起的骨質疏松癥，這些疾病包括內分泌疾病(如皮質醇過多、甲狀腺功能亢進)、腎臟疾病(如尿鈣重吸收減少)、血液病(如多發性骨髓瘤和浸潤骨的惡性腫瘤等)、自身免疫或風濕病(如炎癥性腸病、類風濕性關節炎)、營養不良、吸收不良(乳糜瀉等)等[2]。

骨質流失是一個緩慢的、無癥狀的過程，一般很難發現。因此，骨質疏松癥通常在骨折后才被發現，在早期可以通過改變生活方式、加強營養、戒煙和戒酒來預防骨質疏松癥的發生[3]。目前，骨質疏松癥的一線治療是通過藥物搭配鈣劑來補充日常骨骼代謝所需的成分，減輕或延緩骨質疏松的發生[4]?？构琴|疏松藥物包括減少骨吸收藥物(如雙膦酸鹽和地諾單抗)和加速骨形成藥物或兩者兼備的藥物(如特立帕肽或阿帕羅品)，也有研究提出使用雌激素替代療法來治療骨質疏松癥。這些藥物與治療方法可有效控制骨質疏松癥，減少骨折的風險，但長時間使用帶來的經濟壓力與不良反應是人們難以忽略的。盡管雌激素替代療法在改善骨密度和減少絕經早期骨折發生率方面取得了積極的效果，但雌激素替代療法的長期使用受到潛在并發癥的限制，如乳腺癌、子宮出血和心血管等。雙磷酸鹽類藥物的長期服用會帶來頜骨壞死的風險。在口服雙磷酸鹽類藥物治療骨質疏松癥的患者中，頜骨壞死的發生率似乎相對較低，而在接受大劑量靜脈注射雙磷酸鹽的惡性腫瘤患者中則相對較高[5]。因此，最理想的治療效果是通過強化骨形成來加速新骨的形成，糾正骨質疏松癥所特有的小梁微結構不平衡，這種骨形成強化劑將為骨質疏松癥的治療提供一個新的選擇[6]。

2 奇壬醇對骨質疏松癥的治療作用及機制

骨骼的形成和吸收平衡受多種細胞信號、激素和生長因子的調控，這些信號和因子主要受RANKL與OPG的調節[7]。RANKL在骨髓基質細胞(BMSC)和前骨細胞中，并在T細胞表面高度表達。當RANKL與NF-κB受體活化因子受體(RANK)結合時，破骨細胞的分化和功能就會增強[8]。除上述途徑外，一些合成代謝信號途徑也積極參與骨的形成，如骨形態發生蛋白(BMP)、細胞外因子(Wnt)和Runt相關轉錄因子2(Runx2)等[9]。Baron等[10]研究表明，Wnt途徑的激活會增加骨強度和骨密度，而其失活會增加骨的脆性。Runx2/Cbfa1和成骨細胞特異性轉錄因子(OSX)對產生骨特異性基質蛋白[包括堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)、骨唾液酸蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)等]的基因調節至關重要，并最終刺激骨結核的礦化[11]。

Kir是一種具有生物活性的二萜類中草藥，具有抗風濕的特性。據報道，Kir具有抗炎、促進傷口愈合、免疫調節、抗關節炎和抗光老化的活性[12]。此外，它還能促進成骨細胞的分化[13]。一項骨折愈合實驗研究顯示，Kir的使用可以促進骨折愈合，并隨著劑量的增加，促骨愈合的效果越好，這是由于Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)途徑的早期激活與Runx2途徑的持續活躍加速了骨形成。研究表明，Kir組大鼠在第10天的Wnt3a、β-catenin、T細胞因子(TCF)、脂蛋白相關蛋白5(LRP5)和 Runx2的表達增加量高于對照組，而在第10～21天對照組Wnt3a、β-catenin、Runx2和LRP5的表達增加量高于Kir組，這表明Wnt/β-catenin途徑在骨折愈合的早期階段更加活躍，Kir早期激活Wnt，隨后在鈣化過程中Wnt活性下降。除了對Wnt信號通路的影響外，Kir還增加了Runx2的水平。Kir可能通過促進成骨細胞的分化和增殖來促進骨愈合。此外，β-catenin水平的升高和Wnt途徑的激活可能有助于Runx2水平的增加。并且，Kir也可以通過增加Wnt3a和β-catenin的水平來激活Wnt途徑，加速成骨細胞的生成，這種作用隨著劑量的增加而增強。因此，Kir通過對Runx2和Wnt信號通路的激活促進了骨質合成與骨愈合，減少了骨流失，這使得其可能可以控制以骨量流失為特征的疾病的進展[14]。

破骨細胞是一種大型的多核巨噬細胞，通過分泌抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和蛋白酶來發揮骨骼的吸收功能[15]。破骨細胞的調控主要依靠RANKL-RANK通路、絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)/激活蛋白(AP-1)和 Ca2+-活化T細胞核因子1蛋白(NFATc1)信號通路的轉導[16]。研究[17]表明，分別加入 50 μmol/L RANKL和 30 μmol/L 巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)可刺激破骨細胞分化，再加入1.25 μmol/L Kir處理2 h后發現其對破骨細胞的形成具有抑制作用，且無細胞毒性；此外，1.25～10 μmol/L的 Kir以劑量依賴的方式明顯減少了破骨細胞的骨吸收陷凹深度。單核早幼破骨細胞通過細胞融合的方式形成成熟破骨細胞，并具有骨吸收功能[18]。融合的多核細胞形成一個大的肌動蛋白環(即F-catin)，使其能夠吸收骨質[19]。破骨細胞特異性基因[TRAP、破骨細胞相關受體(OSCAR)、組織蛋白酶K(CTSK)、破骨細胞多次跨膜蛋白(OC-STAMP)、人基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和 β3-整合素)]表達能夠誘導破骨細胞的形成和骨吸收。而研究[20]表明1.25 μmol/L和 5 μmol/L Kir能夠抑制破骨細胞特異性基因的表達，包括 TRAP、OSCAR、OC-STAMP、CTSK和MMP-9。

RANK-RANKL信號通路激活了F-actin的形成，在5 μmol/L Kir的實驗中減少了F-actin的大小和質量，干預和抑制破骨細胞的形成并削弱了骨吸收的過程。NF-κB信號通路在破骨細胞形成的早期階段起著關鍵作用，NF-κB抑制因子α(I-κBα)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)和NF-κB p65作為信號通路成分更容易被檢測到。1.25 μmol/L和 5 μmol/L Kir被證明可抑制I-κBα的降解和p65的磷酸化。5 μmol/L Kir對RANKL誘導的p65細胞質水平的抑制增加了p65的核轉位?？傊?，Kir抑制了RANKL誘導的NF-κB信號通路激活。

除NF-κB外，在破骨細胞分化過程中，MAPK途徑誘導破骨細胞的生成。RANKL刺激MAPK中的p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和細胞外調節蛋白激酶(ERPK)的磷酸化[21]。研究發現，5 μmol/L Kir能明顯抑制p38和ERPK的磷酸化，但不抑制JNK的激活。激活蛋白-1(Ap-1)是破骨細胞分化過程中MAPKs下游的一個關鍵轉錄因子，而c-Fos是 AP-1復合物的一個重要亞單位。研究表明，用RANKL刺激骨髓基質細胞30 min 后，加入Kir可降低 c-Fos基因和蛋白質水平。此外，研究還發現，在 RANKL刺激 24 h后，c-Fos 核蛋白的表達也被 Kir抑制。

在破骨細胞中，NF-κB和MAPK/AP-1的激活會增強NFATc1的核位移，并觸發破骨細胞相關基因的表達，包括 TRAP、OSCAR、CTSK和β3-整合素，最終誘導破骨細胞的分化成熟和骨吸收。NFATc1是破骨細胞核內細胞分化的主要轉錄因子，可被 Ca2+振蕩上調。據報道，NFATc1基因敲除的小鼠會表現出嚴重的骨質疏松與骨量降低[22]。RANKL的刺激則可顯著上調NFATc1基因和蛋白質的表達。此外，NFATc1還受鈣離子內流的調節[23]。然而，窖蛋白(Cav-1)的缺乏會使得破骨細胞在分化過程中下調NFATc1和c-Fos的表達[24]，減少破骨細胞的生成。Cav-1還增加了Ca2+振蕩的發生[25]。加入 1.25 μmol/L Kir處理后，NFATc1蛋白在細胞核中的表達明顯減少。5 μmol/L Kir則可明顯抑制RANKL刺激下的細胞Ca2+振蕩，這與它對NFATc1核轉位的抑制作用一致。有研究表明，Cav-1 mRNA和蛋白質表達都可以被5 μmol/L Kir所抑制。因此，Kir在破骨細胞分化中對 NFATc1的抑制可能是通過抑制Cav-1表達、限制Ca2+振蕩來實現。

事實上，腫瘤壞死因子(TNF)在去卵巢(OVX)小鼠中骨流失作用的機制已經得到驗證。TNF可以增強RANKL活性，誘導生成Th17細胞[26]。Th17細胞可以通過分泌白細胞介素(IL)-17A、RANKL、TNF、IL-1、IL-6以及低水平的γ干擾素(IFN-γ)來有效地誘導破骨細胞的生成，從而刺激骨吸收。IL-17A刺激包括成骨細胞在內的炎癥細胞釋放RANKL并通過上調RANKL活性來增加破骨細胞的活性[27]。在患有骨質疏松癥的絕經后婦女的血清中已經發現，IL-17A水平明顯升高。研究發現，雌激素通過雌激素受體α(ERα)的介導可以抑制CD4+T細胞分化為Th17細胞[28]，減少IL-17A的生成。此外，抑制IL-17A受體或使用抗IL-17A抗體都可能有限地減少OVX大鼠骨質疏松的發生率[29]。這些研究表明了IL-17A在介導骨質流失中的重要性。

在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(eEAE)的研究中發現，Kir可以有效地減少小鼠體內IFN-γ的產生，抑制產生IL-17A的CD4+T細胞的分化，在第25天收集的血清樣本中，與鹽水處理的對照小鼠相比，使用Kir的EAE小鼠血清中IFN-γ和IL-17A水平明顯降低，這說明使用Kir的EAE小鼠體內的Th1/Th17等細胞明顯減少。也有進一步研究[30]顯示，Kir以濃度依賴的方式誘導CD4+T細胞發生凋亡。在膠原蛋白誘導的關節炎(CIA)實驗中，可以觀察到CD4+、CD25+、Foxp3+、 IL-4+、CD4+T細胞數量的增加和IFN-γ+、CD4+T細胞數量的減少。因此，Kir對TNF-α和IL-17A的產生均有抑制作用。在CIA的實驗中也發現，對照組滑液中TNF-α、IL-17A和IL-6的水平增加，而在Kir或潑尼松龍組中的含量明顯降低。也有研究發現，在潰瘍性結腸炎小鼠中，Kir預處理能明顯改善癥狀，減少結腸病變，使用Kir明顯降低了小鼠淋巴細胞對IFN-γ、IL-17A、IL-6和TNF-α的分泌，增加了淋巴細胞的凋亡率，尤其是 CD4+T細胞。這些研究表明，Kir的作用范圍很廣，對多種疾病的相似信號通路都有穩定相似的作用。

Kir不僅對體外抑制破骨細胞生成和破骨細胞功能有積極作用，而且對OVX引起的骨質疏松癥也有積極作用。研究發現，以2 mg/kg Kir與10 mg/kg Kir喂養OVX小鼠后，將股骨組織切片用HE和TRAP染色定量分析發現，小鼠BMD、骨小梁數目與骨小梁體積分數明顯增加，而破骨細胞覆蓋面面積與骨面比和侵蝕面面積/骨面比都明顯減少，小鼠無不良反應；在使用實驗小鼠的左股骨和脛骨骨髓基質細胞進行的進一步培養實驗中，使用 2 mg/kg Kir和10 mg/kg Kir處理能顯著降低破骨細胞的分化和骨吸收能力。該實驗進一步證實了Kir既可抑制破骨細胞的形成，也可減輕因雌激素減低而引起的骨質疏松癥[31]。

Cav-1是一種位于細胞膜上的重要結構蛋白，具有膜運輸、膽固醇調節、內吞作用、細胞生長中信號轉導和鈣平衡的功能，被認為是控制破骨細胞分化的一個功能因子[32]。在OVX小鼠模型組中發現，Cav-1和 NFATc1 mRNA的表達升高，但經2 mg/kg Kir與10 mg/kg Kir處理后，其水平在體內明顯降低，而且破骨細胞中的特異性基因(如 TRAP、ATP6v0d2和CTSK)明顯減少，這表明Kir在體外和體內都能夠抑制破骨細胞發生過程中Cav-1和NFATc1的表達。

3 結 語

骨質疏松癥是一種多因素導致的骨質流失疾病，大大增加了骨折的風險。Kir作為具有生物活性的二萜類化合物，能夠通過抑制多種信號傳導途徑抑制破骨細胞的活性，以減少骨破壞和吸收，同時通過積極的途徑激活破骨細胞的生成以保持健康的骨量。Kir能抑制和屏蔽與各種骨質疏松癥相關的細胞，進一步降低骨質疏松癥的風險，預防OVX誘發的骨質疏松癥。Kir為骨質疏松癥等破骨細胞相關骨骼疾病的潛在治療方法提供了有利的選擇。