黑木耳液體菌種的制備工藝及質量標準

馮偉林 金群力 葉曉菊 呂明亮 蔡為明*

（1. 浙江省農業科學院園藝研究所，浙江 杭州 310021；2. 龍泉市食藥用菌產業辦公室，浙江 龍泉 323700；3. 麗水市農林科學院，浙江 麗水 323050）

菌種是食用菌生產的基礎，而液體菌種較傳統菌種生產效率、接種效率高，是代料食用菌生產實現從傳統生產向專業化、集約化生產升級發展的關鍵技術之一[1]。液體菌種目前僅限于工廠化瓶栽金針菇、杏鮑菇、海鮮菇等少數幾種食用菌生產應用。袋栽食用菌尤其是黑木耳的高效液體菌種生產與應用工藝技術的研究報道較少。

通過對黑木耳液體菌種制備的適宜菌株[2]、配方、發酵條件等開展技術集成試驗，提出安全高效的黑木耳液體菌種制備工藝及質量評價標準[3,4]。

1 液體專用母種的制作

采用PDA綜合培養基制作母種培養基，配方：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO41.5～2 g、MgSO40.5～1 g、水1 000 mL。可根據需要采用營養加富培養基，即在上述配方基礎上，加入20 g麩皮或0.5 g蛋白胨。配制好的培養基用漏斗分裝至試管，試管口壁不粘培養基，塞棉塞，包牛皮紙。每7支或10支捆成一捆，管口用牛皮紙包好，直立于滅菌鍋內，121～126 ℃、0.11～0.15 MPa下滅菌30 min，待培養基冷卻至60～70 ℃，將其擺成斜面，冷卻備用。

當培養基溫度降至30 ℃以下時，于無菌室內接種，品種選用‘黑山’，將菌種用接種鉤接入空白培養基，動作迅速、準確。切取菌種時選遠離原老菌種的部位，一般培養基兩端的活力最強，菌種塊大小為1～2 mm，塊越小菌齡越一致。（26±1）℃避光培養，10天左右菌絲即可長好，菌絲生長健壯、潔白、均勻一致、無雜菌污染的，為優良菌種。

2 搖瓶種制作

選用經試驗優化的配方：葡萄糖3%、蛋白胨0.3%、KH2PO40.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、維生素B10.05%，制備培養基。培養液裝入三角瓶后塞棉塞，外包一層大小合適的紗布，再加蓋一層牛皮紙，用線繩綁好，放入滅菌鍋內。0.10～0.12 MPa，恒壓滅菌35～40 min。待培養基冷卻后，于消毒過的超凈工作臺內，每瓶接種2～3 mm見方的母種塊7～8塊，迅速轉接并封口。于25～27 ℃恒溫箱中靜置培養1天后，置于磁力攪拌器或恒溫搖床上培養6～8天，控制溫度在25～27 ℃，轉速140～160 r/min。

3 發酵罐液體菌種生產

液體菌種生產對環境要求嚴格，生產地點應遠離粉塵污染嚴重的加工廠、公路、鬧市等區域，遠離產生有害氣體的化工廠和養殖場。發酵罐初次使用、長期放置、更換品種或出現雜菌等情況時，應采取煮罐和空消。蒸氣壓力0.15 MPa、溫度126 ℃，維持40 min。

3.1 培養基配制

選用經試驗優化的配方：玉米粉8.4 kg、黃豆粉8 kg、紅糖5 kg、蛋白胨1.2 kg、硫酸鎂270 g、磷酸二氫鉀540 g、水600 L；按照需要加入一定量的消泡劑。

原料加水攪拌均勻，不能有結塊，用吸管或漏斗通過上料口將原料加入罐體，裝液量為罐體容量的70%～80%，通入空氣攪拌1～2 min，混合均勻，擰緊上料口蓋。

3.2 滅菌

發酵罐加熱層通入冷水，水位低于排水口20 cm，關閉進、排水閥門加熱。待加熱層壓力達到0.05 MPa 時緩慢打開排氣閥降壓至0 MPa，關閉排氣閥，再次升壓至0.11 MPa；待發酵罐培養層壓力達到0.05 MPa時緩慢打開排氣閥降壓至0 MPa，關閉排氣閥，再次升壓至0.11 MPa，同時打開空氣過濾器滅菌，微開排氣閥，維持40～50 min。

3.3 冷卻

滅菌結束，關閉空氣過濾器滅菌閥與排氣閥，緩慢打開空氣過濾器排水閥，降壓至0 MPa，加熱層通入冷水降溫；同時緩慢打開發酵罐培養層排氣閥降壓，待壓力接近0 MPa時向培養層內通入無菌空氣，調整排氣閥，維持罐壓0.04～0.05 MPa，培養液溫度降至25 ℃以下時，關閉加熱層進水閥。

3.4 接種

將發酵罐接種口用75%酒精消毒，輕微打開呼吸器閥門，使發酵罐壓力為0.01 MPa。點燃火焰圈，在火焰保護下用鑷子去掉接種管上的牛皮紙和棉塞，打開接種口閥門，將接種管插入接種口，將搖瓶菌種注入發酵罐。拔出接種管，關閉接種閥門，去掉火焰圈，打開空氣壓縮機。

3.5 發酵罐菌種培養

根據菌絲生長情況，適時調節進氣閥，通入適量無菌空氣，同時調節排氣閥，維持罐壓0.04～0.05 MPa，溫度控制在（26±1）℃，培養6～8天。

3.6 接種量

栽培袋折徑為15.8×37.8（cm）的料包，每包接菌種25～30 mL，800 L發酵罐，每罐可供接2萬包以上。

4 黑木耳菌種質量檢測與分析評價

4.1 液體菌種質量標準

色澤方面，菌絲球或菌絲片段呈白色，菌液呈淺黃色至淺棕色、透明。形態方面，菌液稍粘稠，有大量菌絲球或菌絲片段懸浮，分布均勻，不迅速分層，菌液不渾濁。排氣口氣味正常，有黑木耳液體培養時特有的香氣，無酸、臭等異味。顯微鏡下可見黑木耳菌種液體培養中特有的菌絲形態，球狀和叢狀菌絲體大量分布，菌絲粗壯，無雜菌。pH 4.5～5.5，菌絲濕重0.1～0.2 g/mL。

4.2 菌株活性保持檢測

取待用菌液、pH 8.4的Tris-HCl緩沖液和TTC溶液各400 μL至離心管中，于37 ℃反應3 h。反應完成后立即將樣品置于冰上，4 ℃離心再水洗2次，在離心后的細胞沉淀中加入1 mL無水乙醇萃取劑，室溫下從細胞中提取TF。12 000 r/min離心5 min后，取上清液0.7 mL在紫外分光光度計上測定485 nm處的吸光度，每處理3次重復。可用作退化菌株與正常菌株的鑒別指標。

5 優勢與存在問題

由于生產設備投資大，對技術要求高，液體菌種更適合于工廠化大規模生產，不僅縮短生產周期，而且可降低成本。生產中使用液體菌種相比使用固體菌種，具有以下優勢：一是菌絲滿袋快，由于固體菌種接種只在培養料的表面萌發，而液體菌種則從上到下一起萌發，菌絲滿袋速度明顯更快；從接種到菌絲長滿，液體菌種需25～30天，而固體菌種則需要45～55天。二是菌種生產成本低。三是菌種生產周期短。四是栽培袋內菌絲菌齡更為一致，耳更整齊，解決了固體菌種規模化生產中菌種生長同步性差的問題。

雖然生產中應用液體菌種有諸多優勢，但浙江地區以秋耳及春耳為主，液體菌種接種的菌包，培養期往往處于高溫高濕的環境中，菌包極易受到污染而報廢。又由于菌包生產時間集中，液體菌種發酵、接種設備投資大而利用率較低，導致制包公司對其投資不積極，制約了產業發展升級。