紅花檵木季節性花葉表型及其光合生理響應分析

張藝帆，王 慧，霍雯雯，李 陽，劉 洋，曹福祥，李炎林，于曉英，許 璐

(1.湖南農業大學 園藝學院，長沙 410128；2.湖南省中亞熱帶優質花木繁育與利用工程技術中心，長沙 410128)

紅花檵木(Loropetalumchinensevar.rubrum)又稱紅檵木、紅桎木，為檵木變種。紅花檵木因其葉紅花艷，適應性強，耐修剪，易造型，而廣受歡迎，在長江流域及以南地區作為主要的色葉植物大量應用于公園、道路、工廠、校園、社區等綠化中。近年來在生產苗圃和各類園林綠地應用中發現紅花檵木的葉片存在一種異常的“季節性花葉”現象，即在夏秋季節紅花檵木葉片呈現“花葉”狀，冬春季節“花葉”癥狀減弱或消失，而且這種現象越來越普遍。已有研究人員發現該種“花葉”癥狀，認為是植物病毒導致，提出了防治對策，但并未通過試驗明確病原種類和致病機制，該現象發生的原因、機制，以及對植株生長發育的具體影響尚未明晰[1]。相關研究表明植物葉片的呈色與其色素的種類、含量、比例密切相關，而色素不僅影響植物呈色，還影響植物的光合生產力，對植物的生長發育和生態適應性有重要影響，是評價植物生長狀況的重要指標[2]。毛行簡等[3]在對花葉假連翹光合特性的研究中發現，其3種葉色表型葉片光合特性存在的顯著差異與葉綠體層間分布不均有直接關系，同時發現花葉假連翹花葉利用強光的能力較強，在強光環境下其性狀可保持穩定。目前，國內外對紅花檵木花葉研究極少，僅有對其花葉病毒病害癥狀的描述研究，國內圍繞紅花檵木的研究主要集中在正常紅花檵木的栽培管理、生理特性、化學成分等方面[4]。為了解紅花檵木“季節性花葉”具體的表型、機制及對植株生長的影響，本研究在實地勘測、調查、取樣的基礎上，結合表觀特征、發生規律、色素含量、光合特性等對這種“季節性花葉”進行表型分類及其光合能力及適應性的分析，以期為紅花檵木的科學應用與養護及對葉片呈色機理更深入地研究與人為干預調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

光合特性分析試驗材料為湖南農業大學園林花卉教學基地紅花檵木(‘大葉紅’)13 a～15 a地栽成年植株(土壤、水肥管理及修剪等栽培養護措施一致)。

1.2 方 法

1.2.1 花葉調查 于2019年5月至2021年8月在長沙市及周邊地區有紅花檵木應用或生產的園林綠地和苗圃隨機抽取1 m×2 m的樣方(共計292個)統計紅花檵木季節性花葉發生情況， 季節性花葉發生比率=出現花葉的總面積/調查樣方總面積×100%。

表型分類：將花葉與正常葉相比，綜合葉片的大小和顏色進行表型分類。

1.2.2 葉片橫切解剖結構觀察 于2021年7月下旬至8月上旬，選取植物材料葉片5～6片，塑封袋裝好帶回實驗室，在干凈的載玻片在中間滴加蒸餾水，利用切好的土豆為手持物，將葉片夾在其土豆中間用刀片切取薄片蓋上蓋玻片后在光學顯微鏡下觀察，并保存拍照。

1.2.3 光合色素的提取及其含量的測定 于2021年7月下旬至8月上旬，按照于相麗等[5]采用的方法，每種花葉表型類型選取3片同一水平的成年葉片為樣品，將采集的各類型的樣葉用去離子水流水沖洗后拭干其表面，去葉梗及主葉脈，剪碎，用電子天平秤取0.2 g樣品置于10 mL離心管中，加入95%的乙醇作為提取液，定容至10 mL，封口并避光浸泡提取24 h后，再充分混勻溶液，待碎葉片下沉后立即移取上清液置于光徑為1.0 cm的比色皿中，以紫外分光光度計測定其吸光度，記錄提取液在663、645和470 nm處的吸光度，用于計算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、類胡蘿卜素(Car)及總葉綠素[Chl(a+b)]含量，計算公式如下：

Chl a=12.7×A663-2.69×A645×V/1 000W

Chl b=22.9×A645-4.68×A663×V/1 000W

Chl(a+b) =(20.0×A645+8.02×A663)×V/1 000W

Car=(1 000×A470-3.27×Chl a-104×Chl b)/229×V/1 000W

式中：A663、A645與A470分別表示波長在663、645和470 nm處的吸光度；Chl a、Chl b、Chl(a+b)分別表示葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的含量(mg·g-1)，Car表示類胡蘿卜素的含量(mg·g-1)；V為提取溶液的體積，W為葉片樣品的質量。

1.2.4 花色素苷含量的測定 花色素苷的提取方法參照黃欣等[6]，于2021年7月下旬至8月上旬，稱取紅花檵木葉片1.0 g，設置3個重復，剪碎后分別置于40 mL離心管中；加入10 mL的1%鹽酸乙醇提取液，32 ℃恒溫箱中提取 4 h，離心(12 000 r·min-1離心10 min)取上清液，待測，用日立U-2900型分光光度計測定525 nm處吸光度值，用相應的提取液作對照，花色素苷相對含量計算，以每克鮮質量在10 mL提取液中 0.1 OD525為1個色素單位，則：A=吸光度×10(色素單位)。

1.2.5 葉綠素熒光參數的測定 葉綠素熒光的測定使用FluorPen FP 110 手持式葉綠素熒光儀，于2021年7月下旬至8月上旬，各類型的樣葉各選取3片同一水平的葉片，葉片表面擦凈后用葉片夾將其夾住，暗適應15 min后，測定初始熒光(F0)、最大熒光(Fm)、PSⅡ有效光化學量子效率(Fv/Fm)、PSⅡ潛在光化學活性(Fv/F0)等葉綠素熒光參數，然后用葉片夾夾住20 min后測光化學淬滅系數(qP)[7-8]。

1.2.6 光響應曲線的測定 采用LI-6400XT便攜式光合儀進行光響應曲線測定，測定時間為2021年7月下旬至8月上旬，根據劉潔等[9]測定方法，在8:00-11:30 時，樣葉各選取 3 片同一水平的葉片，測定時大氣溫度為 20 ℃～25 ℃，以大氣作為CO2源，制作空氣緩沖瓶以保持CO2濃度的相對穩定，流速為500 μmol·s-1，在0～ 1 800 μmol·m-2·s-1的光照強度范圍內設定15個梯度，分別為2 000、 1 800、1 600、1 400、 1 200、1 000、800、600、400、200、100、80、50、20、 0 μmol·m-2·s-1，每片葉讀取5～10個瞬時凈光合速率(Pn)，參照葉子飄[10]的方法來擬合其光響應曲線，計算表觀量子效率(AQE)、最大凈光合速率(Pnmax)、光飽和點(Lsp)、光補償點(Lcp)以及暗呼吸速率(Rd)。

1.3 數據分析

采用Excel 2016對數據進行處理、Origin 2018作圖、SPSS 19軟件進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 紅花檵木季節性花葉表型分析

2019年5月至2021年8月在長沙市及周邊地區的調查中發現，在園林綠地和苗圃中主栽的紅花檵木‘大葉紅’‘大葉玫紅’‘密枝玫紅’‘長葉玫紅’等品種都有“季節性花葉”現象，且品種間表型差異不明顯。一般自春季5月初開始首先在植株新枝上呈現花葉，然后逐步擴展到老葉、老枝， 7-10月花葉現象最突出，花葉的顏色最鮮艷，冬春季節“花葉”癥狀減弱或消失。這種“花葉”的主要表型特征是葉色為深淺不同綠黃、紅黃相間花葉或完全黃化、白化，或葉色為葉片中有深淺不同紅色斑點或斑塊；葉片正反兩面無明顯病癥，無蟲體及昆蟲排泄物和危害痕跡。

綜合所有調查的292個樣方中花葉表型，根據葉片顏色和大小將紅花檵木這種異常花葉類型分為以下5類典型表型(圖1)：

葉片變小的花葉(A)：葉片縮小到正常葉片大小的1/6以上，最小的葉片大小不足0.04 cm2，葉色為深淺不同綠黃、紅黃相間花葉或完全苗化、黃/白化表型，不同植株間的代表性表型見圖1-A1～A3。

綠黃相間花葉(B)：葉片大小沒有明顯改變，葉色為深淺不同綠黃相間花葉，不同植株間的代表性表型見圖1-B1～B3；紅黃相間花葉(C)：葉片大小沒有明顯改變，葉色為深淺不同紅黃相間花葉，不同植株間的代表性表型見圖1-C1～C3；黃化或白化葉(D)：葉片大小沒有明顯改變，葉片葉肉部分完全黃化或白化，不同植株間的代表性表型見圖1-D1～D3；紅色斑點(塊)花葉(E)：葉片大小沒有明顯改變，葉片中有深淺不同紅色斑塊或斑點，不同植株間的代表性表型見圖1-E1～E3。

A1～A3.葉片變小的花葉；B1～B3. 綠黃相間花葉；C1～C3.紅黃相間花葉；D1～D3.黃化或白化葉；E1～E3.紅色斑點(塊)花葉；CK.正常葉

2.2 紅花檵木季節性花葉現象發生比率分析

對調查區域292個樣方的紅花檵木5類季節性花葉表型類型發生概率進行統計，結果如圖2所示。從圖2中得知表型為紅黃相間花葉類型(C)的發生比率明顯高于其他4種表型類型，高達42.52%；其次是綠黃相間花葉(B)為 22.12%，紅色斑點花葉(E)和葉片變小的花葉(A)的發生比率分別為14.02%和13.86%；完全黃化或白化的表現(D)發生比率最低，僅7.48%。

圖2 紅花檵木季節性花葉不同表型發生比率Fig.2 Occurrence ratio of seasonal mosaic leaf phenotypes of Loropetalum chinense var. rubrum

2.3 葉片橫切解剖結構的觀察分析

5類表型的異常花葉與正常葉片的解剖結構見圖3。根據柵欄組織花青素的分布，葉片變小的花葉(A)與正常葉(CK)的柵欄組織中以花青素占主要地位，葉綠素含量較少；紅黃花葉(C)的花青素含量較少且僅分布于柵欄組織中；紅斑葉(E)葉綠素明顯較多，花青素含量少并呈散點分布；綠黃花葉(B)橫切中葉片富含葉綠素，而未見花青素分布；黃化葉(D)葉綠素含量也較少，葉片失綠，橫切面主要呈黃白色。

圖3 顯微鏡下不同異常花葉各橫切面解剖結構(40×)Fig.3 Cross-sectional structures of different abnormal mosaic leaves under microscope(40×)

2.4 5類表型異常花葉各色素含量的比較

由表1可知，總葉綠素含量以E類(1.77 mg·g-1)最多，顯著高于其他類，D類的總葉綠素含量最少，僅0.15 mg·g-1；CK類花色素苷含量顯著高于其他類，高達3.40 mg·g-1，最少的仍為D類，僅有0.47 mg·g-1；D和B類的類胡蘿卜素含量明顯較高，分別為2.05 mg·g-1和1.89 mg·g-1，最少的是A類，僅為0.14 mg·g-1。通過統計各類3種色素含量的占比可知(圖4)，A類的花色素苷含量占比高達85%，明顯多于其他兩種色素含量，其中類胡蘿卜素含量極少(4%)；B類中類胡蘿卜素和總葉綠素含量均較多，占比分別為51%和33%；C類為花色素苷含量最多，約為一半(53%)，其次為類胡蘿卜素含量較多(36%)；D類中類胡蘿卜素含量明顯較多，占比高達77%，而總葉綠素含量極少(5%)；E類的總葉綠素含量占比最大，高達62%；作為CK類的正常葉以花色素苷含量最多(64%)，其次為總葉綠素含量(26%)。

表1 不同異常葉色表型葉片的各色素含量Table 1 Pigment content of different abnormal leaf color phenotypes mg·g-1

2.5 5類表型異常花葉葉綠素熒光參數的比較

正常葉CK與5種不同表型花葉的葉綠素熒光特性參數見表2，Fm是PSⅡ反應中心處于完全關閉時的熒光產量，Fm值與葉片吸收和傳遞光能的能力呈正相關，初始熒光(F0)可評價逆境對植物葉片PSⅡ永久性損傷的程度，并與植物葉片的葉綠素濃度有關[11]。從表2可知，A類的最大熒光Fm值最高(9 579.67)，而最低的D類僅為3 787.00，顯著低于A類，其余類的Fm值為CK>B>E>C；6類樣品中初始熒光值F0最高的是E類(3 835.00)，顯著高于其他組，而D類F0值為最低(1 869.00)，其他類F0值為CK> A>B>C；PSⅡ 的潛在光化學活性Fv/F0值最高的是A類 3.63，其次為CK的3.34及E類的 2.86，3類均顯著高于其他類；而Fv/Fm值的規律同Fv/F0值基本一致。光化學淬滅系數qP為CK>E>C>B>A>D，且D類顯著低于其 他類。

表2 5類表型異常葉與正常葉的葉綠素熒光特性比較Table 2 Comparison of chlorophyll fluorescence characteristics between five abnormal leaves and normal leaves

2.6 5類表型異常花葉葉片的光合參數比較

植物的光合能力取決于本身的遺傳特性，不同種類間光合能力均存在較大差異[12]。不同花葉葉片光合參數的比較如圖5和表3所示，在 0～2 000(μmol·m-2·s-1)的光照強度范圍內，隨著光合有效輻射(PAR)的增加，正常葉色樣品和不同類型的異常葉色樣品的凈光合速率(Pn)均呈線性增加，當PAR達到一定值時，Pn達到最大值，即達到光飽和點，所有樣品材料的Pn均先增加達到最大值后趨向穩定。6類樣品的表觀量子效率(AQE)為D>C>B>A>CK>E，其中D類顯著高于其余5類；光飽和點為CK>E>B> C>A>D，且各類間對比差異較大；最大凈光合速率為CK>B>C>E>A>D，且CK為12.78 μmol·m-2·s-1，顯著高于其他類；光補償點由高至低依次為C>A>D>E>B>CK，最高的C類(49.52 μmol·m-2·s-1)顯著高于CK類 (6.28 μmol·m-2·s-1)；暗呼吸速率為A>C>D>B>E>CK，且各類間的差異顯著。

圖5 5類異常葉與正常葉的光響應曲線比較Fig.5 Comparison of light response curves between five abnormal leaves and normal leaves

表3 6種類型葉片的光合-光響應曲線特征參數

3 結論與討論

本研究對分布于長沙7個行政區的居住小區、市政道路和學校校園綠地3類樣區中的紅花檵木異常葉色發生情況進行調查，將紅花檵木異常葉色按葉片顏色和大小為依據分類，共分為葉片變小的花葉(A)、綠黃相間花葉(B)、紅黃相間花葉(C)、黃化或白化葉(D)、紅色斑點(塊)花葉(E)共5類典型表型。其中C類型發生比率最高，D類型發生比率最低，C類型發生比率最高的原因可能是因為紅花檵木異常葉色主要發生于枝條頂端修剪后的新葉，正常新葉展葉后應為紫紅色所致；而B類花葉的產生可能是由于紅花檵木具有高溫返青的特點，葉片返青后發生黃化而出現綠黃異常花葉；至于這些季節性的異常花葉具體誘因是生物因子還是非生物因子還有待進一步的深入研究。

總葉綠素、類胡蘿卜素及花色素苷含量之間的比例不僅與葉色相關[13]，也與光合能力有關，另外，葉綠素熒光參數也能夠反映植株葉片的光合效率和潛在能力[14]。有研究表明[15-16]，植物體中葉綠素含量越高，越有利于陰生植物在弱光條件下有效地吸收光能；類胡蘿卜素既可作為光合色素，又是植物的內源抗氧化劑，在提升葉片利用藍紫光能力的同時增強葉片的光合效能[17]；花色素苷能夠防御光破壞，具有維持和完善植物的光合功能的能力[18]。本研究對5類異常花葉光合特性及色素含量的測定中發現，CK葉花色素苷占比最多，總葉綠素次之，類胡蘿卜素最少，葉片呈現均勻的紫紅色，葉片吸收及傳遞光能的能力較強，光合作用效率較高，最大凈光合速率、表觀量子效率及光飽和點較高，光補償點較低，暗呼吸速率最低，有機物積累能力較強，反映其對光的適應性較強[19]。與CK相比，E類葉葉綠素含量較高，A類葉花色素苷含量較高，各光合參數僅次于CK，葉綠素熒光參數與正常葉較為接近，光合能力及對環境的適應能力較好。此外，根據前人研究結論可知，PSⅡ原初光能轉換效率值(Fv/Fm)可代表植物的潛在最大光合能力，PSⅡ 有效光化學量子效率(Fv/F0)指標能體現光系統PSⅡ的潛在光化學活性，且該值越高說明植物的光合性能越強，以上兩個指標作為植物發生光抑制的敏感指標，用于評估植物對環境的適應性，來判斷植物生長是否受到抑制[8, 20-21]，Fv/Fm應在 0.75～0.85[22]，實測表觀量子效率(AQE)應在 0.03～0.05[23]。本研究發現，僅CK與E的AQE，CK與A的Fv/Fm介于或接近上述范圍，表明A、E類花葉抵御光系統破壞的能力相對較好，而B、C、D 3種類型均與此范圍相差較遠，表明受外界影響較大[24]，總體光合能力B優于C、D；且E類qP值較高，表明其有較高的光能利用效率，對自身光合機構保護能力也較強[25]，這可能是由于E類葉葉綠素含量顯著高于包括對照的其他組，因此并未由于出現紅色斑塊而降低光合能力；本研究還發現，CK的總葉綠素含量次于E類的紅斑葉，而CK的Pnmax是顯著高于其他類型花葉。高陽等[26]研究中同樣發現，蔭蔽環境中的大豆葉片葉綠素含量最多的種類其Pnmax卻不是最大的，葉綠素含量并不一定與Pnmax成正比，還需參考其生長環境，根據前期的實際調查發現，本研究的E類葉在蔭蔽環境中生長較多，因此有可能是E類葉適應蔭蔽環境的一種體現。A類花葉光合面積減少，花色素苷含量同樣占比較多，因此抵御外界對光合系統的破壞能力較強。D類葉各種色素含量、光合作用效率、有機物積累能力基本均最低，表明其適應能力最差，受到環境的影響最大。

綜上所述，與正常葉相比，紅花檵木葉片呈現季節性花葉的表型不同，其光合生理均有不同的響應表現，A、E類的花葉的出現對植株來說受到的消極影響較小；此外，B、C、D 3類花葉的各項指標與CK相比均較差，綜合各種指標來說，B優于C，D最差。可見，這3類花葉對植株來說受到的消極影響較大。本研究為今后進一步探究紅花檵木花葉形成的具體原因及形成機理奠定基礎。