不同溫度對皂莢幼苗生長和生理特性的影響

劉富華,王秀榮,趙 楊*,何可權

(1.貴州大學 林學院/貴州省森林資源與環境研究中心，貴州 貴陽 550025 ；2.獨山縣國有林場，貴州 獨山 558200)

皂莢(Gleditsiasinensis)是豆科皂莢屬落葉喬木，適應性強，分布廣，是優良的經濟生態樹種，是貴州省重要的特色經濟林木，于2018年被列入特色林業來重點發展，以畢節為主的喀斯特石漠化地區為其主要種植區，帶動全省皂莢產業實現標準化生產、產業化經營、規模化發展。貴州省地貌類型復雜，海拔高度變化大，立體氣候明顯，省內多地苗圃所育皂莢苗木生長差異明顯。溫度是影響植物光合作用的關鍵因子之一，是決定其地理分布范圍、生長發育、果實產量及質量的主要因素。當溫度高于或低于臨界溫度時，植物體內代謝失衡、活性氧、自由基和丙二醛(MDA)積累，造成膜透過性上升，電解質外滲，細胞膜系統嚴重受損，同時光系統Ⅱ(PSⅡ)受到一定傷害，原初光能轉換效率下降，電子傳遞活性減弱，光合作用受到抑制，阻礙植物生長[1]。木薯(ManihotesculentaCrantz)[2]幼苗受到高溫脅迫時氣孔導度、蒸騰速率和凈光合速率顯著下降。低溫下綠蘿(Scindapsusaureus)[3]和毛白楊(PopulustomentosaCarr)[4]幼苗葉綠素含量降低，龍葵(SolanumnigrumL.)[5]幼苗Fv / Fm、qP均降低，qN增大。當溫度超出20～30 ℃范圍時，紅心衫(Cunninghamialanceolata)[6]、糖膠(Alstoniascholaris)[7]、辣木(M.oleiferaLam.)[8]幼苗MDA、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)酶活性均顯著升高，生長指標、葉綠素含量、光合作用和葉綠素熒光參數都會受到抑制，嚴重影響幼苗生長。

隨著全球氣候變暖，溫室效應加劇，貴州地區春夏季氣候異常，春寒和高溫時有發生，皂莢幼苗大面積死亡時有發生，制約著皂莢培育的發展。皂莢已成為重要的經濟生態樹種，大規模批量種植已成趨勢，國內對皂莢的價值、栽培或改造技術方面報道較多。近幾年，貴州有大量引進北方皂莢種源，在引種栽培過程中溫度是重點考慮的因素，開展皂莢對不同溫度環境生態適應性方面的研究卻鮮有報道，尤其在幼苗對不同溫度中的生理響應方面未有研究。幼苗是植物重要的生活史階段，幼苗的生長溫度是其能否存活的關鍵因素。為此，本文探索不同溫度下生長的皂莢幼苗生長指標、光合特性和抗性生理指標的差異，尋找適合的育苗溫度，為皂莢繁育提供參考依據，為皂莢幼苗培育溫度調控提供理論依據與指導，促進皂莢幼苗標準化生產。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設計

供試皂莢種子采摘于貴州省貴陽市花溪區一株野生大樹(106°39′27″E，26°27′13″N)，經凈種催芽處理[9]，于2021年3月15日進行容器育苗。3個月后選取長勢一致的幼苗，在人工氣候室內選取5個條件相同的恒溫培養箱中培養，均分為三層。溫度分別設置為15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，每個處理設置18盆苗，3次重復。每盆種植一株幼苗，并定時更換每個重復苗木的擺放位置，培養90 d。光照強度300 μmol/m2·s、相對濕度55%、光周期設置為光期∶暗期=12∶12(h)，定時澆水保持土壤濕潤。

1.2 測定指標與方法

1.2.1苗高、地徑的測量

測量苗高和地徑均隨機選取6株取平均值。苗高用直尺測量，精確到0.1 cm；地徑用游標卡尺測量，精確到0.01 mm。

1.2.2光合色素含量測定

光合色素采用分光光度法[10]測定。將采集的新鮮葉片去除葉脈剪碎混勻，精確稱量0.2 g(精確度0.001 g)放入干燥研缽中，加入液氮快速研磨至粉末狀。先后加入95%乙醇3 mL和5 mL，繼續研磨成勻漿狀后靜置3～5 min，將勻漿過濾后的液體全部移入25 mL棕色容量瓶中，并用95%乙醇定容，搖勻后靜置12 h。以95%乙醇為空白對照，使用UV-1800紫外分光光度計在665、649和470 nm波長下測定葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)的吸光度。按照公式計算每克葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量，每個溫度處理測定設置3次重復取平均值。

Chla=(13.95A665-6.88A649)×V/l000 m

Chlb=(24.96A649-7.32A665)×V/l000 m

Car=[(1000A470-2.05Chla-114.8Chlb)/245]×V/l000 m

總葉綠素=葉綠素a+葉綠素b

1.2.3葉綠素熒光動力學參數測定

每個處理每個重復中選取一盆從上往下第2～4片健康良好的2片葉進行標記，于21∶00～23∶00，葉片暗適應40 min 后，用便攜式熒光儀(Junior-PAM-Ⅱ)對皂莢幼苗葉片先進行慢速誘導動力學曲線測定，測定最小熒光(Fo)、最大熒光(Fm)，隨后設置0～1500 μmol/m2·s范圍的9個梯度的光強進行快速光響應曲線參數測定[11]，測定PS Ⅱ最大光化學效率(Fv/Fm)、實際光化學量子產量(Fv′/ Fm′)、PS Ⅱ實際光化學量子效率(YⅡ)、光化學淬滅系數(qP)和非光化學淬滅系數(qN NPQ)、調節性能量耗散Y(NPQ)和非調節性能量耗散Y(NO)、相對電子傳遞速率(ETR)、最大電子傳遞速率ETRmax、初始斜率(α)、光抑制參數(β)和半飽和光強(Ik)。

1.2.4生理指標測定

剪取每株幼苗3～4片葉片剪碎混勻，去除主脈貯藏于-80 ℃的冰箱中用于葉片生理生化指標的測定。參照李合生[12]的方法，采取硫代巴比妥酸比色法測定MDA的含量；采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量；采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量；采用酸性茚三酮法測定游離脯氨酸含量；采用紫外分光光度法測定 CAT 酶活性；采用氮藍四唑(NBT)法測定 SOD 酶活性；用愈創木酚法測定POD 酶活性。參照Nakano[13]的方法測定抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性。各項指標均測定 3次，取平均值。

1.3 數據分析

采用Excel 2019軟件進行數據處理，Origin2021軟件進行圖形繪制。采用 IMB SPSS Statistics 26 軟件進行單因素方差分析，采用 Duncan進行多重比較和差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同溫度處理對皂莢幼苗生長指標的影響

如圖1所示，皂莢幼苗苗高和地徑兩個指標均隨溫度升高呈現先上升再下降的趨勢。25 ℃和30 ℃處理下的苗高和地徑均顯著高于其他3個處理，其中，25 ℃處理最大，15 ℃處理最小。25 ℃處理苗高和地徑分別為14.8 cm和3.50 mm，15 ℃處理苗高和地徑分別為12.2 cm和3.00 mm。苗高和地徑均表現為25 ℃>20 ℃>30 ℃>35 ℃。

注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P< 0.05)。圖1 不同溫度對皂莢幼苗生長的影響Fig.1 Effects of different temperatures on the growth of G.sinensis seedlings

2.2 不同溫度對皂莢幼苗葉綠素含量的影響

由表1可知，不同溫度對皂莢幼苗葉片葉綠素含量有顯著的影響。在15～30 ℃范圍內隨溫度的升高皂莢幼苗葉片中葉綠素 a、葉綠素 b、類胡蘿卜素和總葉綠素含量均升高，葉綠素 a、葉綠素 b、類胡蘿卜素、總葉綠素含量在25 ℃和30 ℃處理急劇上升，在35 ℃處理時輕微下降。25 ℃處理葉綠素 a、葉綠素 b、類胡蘿卜素、總葉綠素含量均為最高，分別為0.787 mg/g、0.289 mg/g、 0.351 mg/g、 1.076 mg/g。葉綠素a/b 質量分數隨溫度升高而下降。

表1 不同溫度對幼苗葉片葉綠素含量的影響

2.3 不同溫度對皂莢幼苗葉片葉綠素熒光參數的影響

2.3.1不同溫度處理下 Fo、Fm、Fv/Fm與Fv/Fo的比較

由表2可知，隨溫度升高，皂莢幼苗葉片Fo、Fm、Fv/ Fm、 Fv/ Fo均表現出先上升后下降的趨勢。25 ℃處理的Fo、Fm、Fv/Fm、潛在光化學活性(Fv/ Fo)最高，顯著高于其他處理(P<0.05)，其次是20 ℃和30 ℃處理。15 ℃和35 ℃處理Fo、Fm、Fv/Fm、Fv/ Fo較低。

表2 不同溫度葉綠素熒光參數

2.3.2不同溫度下PSⅡ反應中心參數變化比較

由圖2可知，在光響應變化過程中，不同溫度處理的Fv′/ Fm′和Y(Ⅱ)均隨著光合有效輻射(PAR)升高而降低，Fv′/ Fm′下降幅度較小。25 ℃處理Fv′/ Fm′和Y(Ⅱ)最高，顯著高于其他處理(P<0.05)。Fv′/ Fm′和Y(Ⅱ)均隨溫度升高而先升高后降低。

圖2 不同溫度有效光化學量子產量 Fv′/ Fm′和實際光合量子產量 Y(Ⅱ)和的光響應Fig.2 Light response of effective photochemical quantum yield Fv′/Fm′ and actual photosynthetic quantum yield Y(Ⅱ) and under different temperature

由圖3可知，不同溫度下qP隨著 PAR的增加而減小,在低光強下，qP、NPQ和qN變化比較大，在625～1500 μmol/m2·s內逐漸穩定。不同溫度處理qP值隨溫度升高而先升高后下降25 ℃處理的qP值最大，15 ℃處理qP值最小。不同溫度處理的NPQ和qN隨著PAR的增加而增大。15 ℃處理NPQ和qN最大，顯著高于其他處理，35 ℃處理NPQ和qN最小。

圖3 不同溫度光化學淬滅系數qP與非光化學淬滅系數(NPQ 、qN)的光響應Fig.3 Light response of photochemical quenching coefficient qP and non-photochemical quenching coefficient (NPQ,qN) at different temperatures

由圖4可見，不同溫度處理的Y(NPQ)值隨PAR增加而逐漸升高，PAR<420 μmol/m2·s時，各處理的Y(NPQ)值急劇上升，當 PAR>420 μmol/m2·s之后Y(NPQ)值趨于飽和。Y(NPQ)在整個變化過程中，15 ℃處理的Y(NPQ)顯著高于其他處理(P<0.05)，其他處理之間Y(NPQ)差異不顯著，30 ℃處理Y(NPQ)最小。Y(NO)隨PAR的增加整體波動較小，30 ℃處理Y(NO)值最大，15 ℃處理的Y(NO)值最小。

圖4 不同溫度調節性Y(NPQ)和非調節性Y(NO)能量耗散參數的光響應Fig.4 Light response of different energy dissipation parameters of temperature-regulated Y(NPQ) and non-regulated Y(NO)

由圖5可知，低光強下各處理電子傳遞速率(ETR)值迅速升高，當 PAR>420 μmol/m2·s時,各處理ETR值趨于飽和，各處理之間差值穩定。不同溫度處理的ETR隨PAR的增加而呈現先上升后下降的趨勢，25 ℃處理ETR值最高，15 ℃處理ETR值最小。25 ℃處理和20 ℃處理ETR值較高。

圖5 不同溫度電子傳遞速率(ETR)的光響應Fig.5 Light response of electron transfer rate (ETR) at different temperatures

由表3可知，隨著溫度升高，最大電子傳遞速率(ETRmax)、初始斜率α、光抑制參數β、半飽和光強Ik值呈先上升后下降的趨勢，各處理之間差異顯著。25 ℃處理的 ETRmax、α、β、Ik最高，均顯著高于其他處理(P<0.05)。15 ℃處理ETRmax、α、β、Ik最低。

表3 不同溫度光響應曲線擬合參數

2.4 不同溫度對皂莢幼苗葉片生理指標的影響

2.4.1不同溫度對皂莢幼苗葉片MDA和滲透調節物質含量的影響

隨溫度升高，皂莢幼苗葉片MDA含量呈先降后升趨勢(表4)。在 20 ℃和25 ℃處理MDA 含量保持較低水平， 15 ℃和35 ℃處理MDA 含量顯著增加，35 ℃處理MDA 含量最高。不同溫度處理對幼苗可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量有顯著影響。隨溫度升高，可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量呈現先降低再升高的趨勢。在20～30 ℃范圍內可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量差異較小，均保持較低水平。15 ℃和35 ℃處理可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量顯著高于其他3個處理(P<0.05)，均保持較高水平，15 ℃和35 ℃處理脯氨酸含量分別是25 ℃的1.74倍和1.59倍。15 ℃處理可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量均為最高，25 ℃處理可溶性蛋白、可溶性糖含量最低。

表4 不同溫度對皂莢幼苗葉片MDA和滲透調節物質含量的影響

2.4.2不同溫度對皂莢幼苗抗氧化酶活性的影響

在 20～30 ℃范圍，幼苗保護性酶CAT、SOD、POD和APX活性均保持較低水平(表5)。 隨著溫度的升高或降低，保護性酶活性逐漸增強，其中CAT和SOD活性的增強更為顯著 。15 ℃和35 ℃處理CAT、SOD、POD和APX活性均顯著高于其他3個處理。25 ℃處理CAT、SOD、POD和APX活性分別為624.31 μmol/g·min、161.07 U/g·min、41.67 U/g·min、50.01 μmol/g·min。相比較25 ℃處理，15 ℃和35 ℃處理CAT升高至1.9倍和1.6倍；SOD升高至5.7倍和6.8倍；POD升高至1.7倍和2.2倍；APX升高至1.2倍和1.32倍。

3 結論與討論

不同溫度下皂莢幼苗的生長指標、光合特性及生理指標不同。通過對比幼苗的生長指標、光合特性及生理指標可知,25 ℃是皂莢育苗最適宜的溫度。超出20～30 ℃范圍幼苗的生長指標會明顯降低，光合作用下降，MDA含量、滲透調節物質含量和抗氧化酶活性會顯著上升，不利于幼苗生長發育。

表5 不同溫度對皂莢幼苗抗氧化酶活性的影響Tab.5 Effects of different temperatures on antioxidant enzyme activities of G.sinensis seedlings

在高溫和低溫環境條件下，植物光合作用隨著溫度脅迫而下降，光合作用相關的酶活性降低，光合作用受到限制，導致植物營養物質的合成與積累受阻，從而影響植物苗髙、地徑的生長。辛福梅等[14]研究發現高溫和低溫脅迫均抑制巨柏(Cupressusgigantea)幼苗的生長，導致株高、地徑、生物量和生根數量均有所降低。本試驗中，15 ℃和35 ℃對皂莢幼苗苗高和地徑有明顯的抑制作用。比較苗高、地徑可知，皂莢幼苗最適宜生長在25 ℃，在15 ℃和35 ℃下生長較差。

溫度對葉綠素含量有一定的影響，陳青君等[15]發現，溫度脅迫會使黃瓜(CucumissativusL.)幼苗葉綠素含量顯著下降，與本試驗研究趨勢一致。在低溫時，酶促反應降低，引起光合反應降低，導致葉綠素含量下降，這可能是造成15 ℃時皂莢葉片葉綠素含量比較低的原因。25 ℃和30 ℃處理葉綠素含量保持較高水平，說明皂莢幼苗在此溫度下光合作用較強，適宜在此溫度范圍內生長。葉綠素的合成需要絕大部分酶的參與，在15 ℃和35 ℃處理時光合色素較低，可能是由于溫度脅迫致使酶活性下降甚至失活導致光合色素合成減少，或是葉綠體自身功能的紊亂造成，葉綠素的分解速率加快，分解大于合成，也可能是葉綠素合成的中間產物5-氨基酮戊酸和卟啉IX的生物合成，降低葉綠素生成量[1]。葉綠素a/b值隨溫度升高明顯下降，低溫下生長的羅勒(Ocimumbasilicum)幼苗葉綠素a/b比值明顯高于高溫下生長[16]，這與本試驗研究趨勢一致。葉綠素a/b比值的降低,是由于溫度的升高，葉綠素a被氧化成葉綠素b,使葉綠素b的含量上升所致。

葉綠素熒光參數可以反映光合作用熱耗散情況和環境因子對植物光合作用及脅迫響應的影響[17]，表示其抗逆性[18]。Fm反映PSⅡ的電子傳遞情況；Fv/Fo可衡量PSⅡ潛在光合活性；Fv′/Fm′反映實際捕獲能量的傳遞效率；Y(Ⅱ)表示實際光能轉化效率[19]； Y(NPQ)代表光保護能力。本試驗研究表明，25 ℃處理的皂莢幼苗的Fm、Fv/ Fo、Fv/ Fm、Fv′/Fm′、Y(II)和qP高于其他處理組，說明25 ℃處理皂莢幼苗PSⅡ反應中心光合原初反應能量轉化效率和光合電子傳遞速率較高，實際光合效率最高，光合作用較強，PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞份額較高。而15 ℃和35 ℃處理較低，說明高溫和低溫環境下幼苗受到了光抑制作用，導致 PSII光合效率和實際量子產量均受到抑制，幼苗光合結構以及 PSⅡ活性中心損害，天線色素捕獲的光能無法推動光合電子的傳遞，電子傳遞受阻，光能利用率下降，這與王璐等[20]的研究結果一致。

皂莢幼苗在光響應過程中，提高qN、NPQ減少光能對光系統的破壞。在15 ℃處理下的qN最高，說明此溫度下通過qN調節過量能量耗散的能力下降，低溫下幼苗將大部分吸收而來的光能用于熱耗散，這與楊盛昌等[21]研究低溫對紅樹(Rhizophoraapiculata)的影響趨勢一致。qN和NPQ隨著溫度的升高而降低，說明隨溫度升高幼苗將過剩光能熱耗散能力下降。對比qP、qN和NPQ可發現，皂莢幼苗葉片熒光參數發生淬滅方式主要為非光化學淬滅。隨著 PAR 的增加，Y(NPQ) 明顯增加，表明幼苗通過調節 Y(NPQ) 來減少過剩光能對光系統結構的損害，與錢永強等[22]研究銀芽柳(Salixleucopithecia)趨勢一致。Y(NO)表示光損傷程度，皂莢幼苗在30 ℃以上時光損傷程度較高。25 ℃處理實際光量子產量最大，但Y(NPQ)、Y(NO)并不是最小的，15 ℃時光保護能力最大，光損傷最小，說明幼苗可以通過不同的作用機制進行適應性調節以抵御溫度脅迫，這與李兵陽[7]研究趨勢一致。幼苗可通過提高電子傳遞速率來響應能量過多耗散帶來的影響。25 ℃處理ETR 、ETRmax 、光能利用效率(α) 、光抑制參數(β) 和光耐受能力(Ik)最高，說明其電子傳遞鏈傳遞速率最高，光化學反應啟動較快，耐光抑制的能力較強，15 ℃和35 ℃處理耐光抑制能力較弱。

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物體內重要的滲透調節物質，能夠降低水勢，增加持水力，防止細胞過度失水，從而減少低溫和高溫環境對植物體造成的傷害，并提高抗寒性和抗高溫性[1]。15 ℃和35 ℃處理可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量顯著增加，說明此溫度脅迫下幼苗會受到傷害，從而主動積累會通過增加滲透調節物質含量來調節適應環境溫度脅迫，這與張天翔等[8]和韓曉燕等[27]的研究趨勢一致。可溶性蛋白含量增加，可能是受溫度脅迫糖酵解途徑轉變為磷酸戊糖途徑，從而產生較多的NADPH和ATP，有利于蛋白質的合成[1]，或是幼苗體內誘導產生了與抗寒、抗高溫有關蛋白的合成，促使幼苗增加抗逆性。可溶性含量增加，可能是溫度脅迫使淀粉等大分子物質水解成可溶性糖的速率加快。

本試驗對皂莢幼苗經過不同溫度處理90 d后的生長指標、光合色素和生理指標進行比較，初步探索了皂莢幼苗對不同溫度處理的生理響應。若要更深入研究探討皂莢幼苗的抗寒性和抗熱性的生理生化機制，需脅迫下皂莢生理指標的動態變化測定記錄，做進一步的探索。本試驗幼苗的生長環境是人工模擬環境，與自然環境相比，影響因素較少，若要探究適合的育苗環境，需要增加多種因素綜合分析比較。本文未對不同種、不同種源的皂莢進行比較分析研究，在引進其他種源之前應進行試驗并分析其可行性。

皂莢幼苗生長在不同溫度下其生長指標、光合特性及生理指標表現不同。25 ℃處理苗高地莖值最大，葉綠素含量最高，光合作用較強，實際光合量子產量較高，光損傷程度較輕，耐光抑制能力較強。MDA含量、滲透調節物質含量和抗氧化保護酶活性隨溫度升高呈現先下降后升高的趨勢。15 ℃和35 ℃處理幼苗MDA、滲透調節物質含量和抗氧化保護酶活性急劇上升，以提高抗逆性。25 ℃下皂莢幼苗不易受活性氧和自由基危害，滲透調節作用平衡，是最適宜的育苗溫度。