銅離子對中華絨螯蟹鰓ATP酶活性的影響

顏逢緣，周春妙，陳 雪，馮文榮,3，宋長友,3，唐永凱,,3

（1.水產科學國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306 ；2.南京農業大學 無錫漁業學院，江蘇 無錫 214128；3.中國水產科學研究院 淡水漁業研究中心/農業農村部 淡水漁業與種質資源利用重點實驗室，江蘇 無錫 214081）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又稱河蟹、大閘蟹，是我國重要的淡水養殖蟹類。在養殖過程中，為了防止青苔以及藍藻的暴發，含硫酸銅成分的藥物常會在生產中使用。銅離子在甲殼動物體內承擔著機體代謝、生長發育和免疫調節的功能，對其造血、細胞繁殖以及酶的活性都有重要的影響，是甲殼動物生長發育的必需微量元素［1-2］。然而過量的銅離子不僅會引起水生生物各個器官和組織發生氧化損傷，還會引發神經退行性疾病；但機體內存在調節銅離子動態平衡的機制，防止過量的銅離子對機體的毒害作用［3-4］。中華絨螯蟹對離子的吸收主要通過鰓呼吸作用、攝食吸收和體表吸附3種途徑［5-6］。自然條件下，水環境的銅離子大部分都是通過呼吸作用進入鰓組織，再通過全身血淋巴循環和其他一系列的生理反應運輸到身體各個部位［7］。中華絨螯蟹鰓表面有一層較薄的粘液，水體中的銅離子通過呼吸作用進入鰓組織后會被粘液吸附在鰓表皮，致使鰓中的銅離子含量較高，從而影響中華絨螯蟹鰓的離子轉運和滲透壓平衡調節［8］。

腺苷三磷酸酶（ATPase）是中華絨螯蟹體內重要的酶，參與細胞內的離子轉運和滲透壓調節，廣泛存在于所有細胞中。從分子生態毒理學的角度來看，ATPase是一項評價環境污染壓力的重要參數［9-10］。鈉鉀ATP酶（Na+/K+-ATPase）能夠調節細胞內鈉/鉀離子的濃度；鈣ATP酶（Ca2+-ATPase）能夠維持細胞質Ca2+處于靜息水平［11-12］。當環境中銅離子濃度較高時，會造成水生生物中毒反應，抑制ATPase的活性［13-14］。鑒于硫酸銅在中華絨螯蟹養殖中經常被使用，本文測定了銅暴露后中華絨螯蟹鰓組織鈉鉀ATP酶和鈣ATP酶的活性，并從基因表達水平測定了鈉鉀腺苷三磷酸酶基因（NaK-ATPase）、V型腺苷三磷酸酶基因（V-ATPase）和鈉—鉀—氯共轉運體基因（Na+/K+/2Cl--co-transporter，NKCC）的表達情況，從酶活性和基因表達這2個方面探討了銅離子對中華絨螯蟹鰓ATP酶的影響，旨在為中華絨螯蟹養殖中的硫酸銅應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用中華絨螯蟹來自中國水產科學研究院淡水漁業中心陽澄湖蝦蟹綠色養殖基地。選擇個體健康的中華絨螯蟹（129.92±24.21） g，在玻璃缸中暫養7 d以適應試驗環境。每天18:00按體重的2%投喂一次成蟹飼料，投餌前吸凈殘餌。Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和BCA試劑盒均購于南京建成海浩生物科技有限公司；Trizol、反轉錄試劑、實時熒光定量PCR（qPCR）試劑均購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物由亦欣生物科技（上海）有限公司合成。

1.2 銅離子脅迫試驗設計

在前期試驗的基礎上，設置5個銅離子濃度組，分別為0、0.17、0.69、2.77和11.08 mg/L。每個銅離子處理組設3個重復，每個重復試驗8只中華絨螯蟹。水溫（21±2） ℃，pH值介于6.9～7.8，連續充氣，自然光照。當飼養到第5天和第10天時，每個處理組隨機取6只中華絨螯蟹，冰浴麻醉后取鰓組織，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中，用于酶活性測定和RNA提取。

1.3 酶活性測定

取0.1 g鰓組織置于生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，剪碎，加入9倍體積的0.9%生理鹽水，勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液用于酶活性測定。采用比色法測定ATP酶活性，Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和蛋白濃度測定均按照試劑盒說明進行。ATP酶活性單位定義為：每小時每毫克組織中ATP酶產生1 μmol無機磷的量為1個酶活性單位。

1.4 qPCR檢測基因表達

采用Trizol提取鰓組織總RNA，用HiScriptⅡ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）進行反轉錄合成cDNA。qPCR反應體系為20 μL：ddH2O 6 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，模板2 μL，10 μmol的上、下游引物各1 μL。擴增條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；增加融解曲線步驟以驗證引物的特異性。用2-ΔΔCt方法［15］計算目的基因的相對表達量。目標基因NaK-ATPase、V-ATPase、NKCC的特異性引物如表1所示，內參基因為GAPDH。

表1 試驗所用基因的引物序列

1.5 數據處理與分析

所有試驗數據用平均值±標準誤（mean±SE）表示，并使用SPSS軟件中的單因素方差分析（oneway ANOVA）和Duncan多重檢驗分析各組間數據的差異性，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鰓Na+/K+-ATP酶活力

由圖1可以看出：當中華絨螯蟹暴露5 d時，隨著水中銅離子濃度的升高，Na+/K+-ATP酶活力呈先升高后下降的趨勢，當銅離子濃度為0.69 mg/L時，Na+/K+-ATP酶的活力最高，與對照組和其他試驗組均存在顯著差異（P＜0.05）。10 d時，Na+/K+-ATP酶的活力在銅離子濃度為0.69 mg/L時最高，對照組以及0.17、0.69 mg/L試驗組間無顯著差異，但顯著高于2.77、11.08 mg/L試驗組的（P＜0.05）。當銅離子濃度為0.69 mg/L時，中華絨螯蟹暴露5和10 d的Na+/K+-ATP酶的活力存在顯著差異（P＜0.05），且5 d的Na+/K+-ATP酶活力大于10 d的。

圖1 CuSO4·5H2O暴露下中華絨螯蟹鰓 Na+/K+-ATP酶活力

2.2 鰓Ca2+-ATP酶活力

由圖2可以看出：當中華絨螯蟹暴露5 d時，隨著銅離子濃度的升高，Ca2+-ATP酶活力呈現出先上升后下降的趨勢。在銅離子濃度為0.69 mg/L時，Ca2+-ATP酶的活力最高，并且與其他試驗組有顯著差異（P＜0.05）。10 d時，Ca2+-ATP酶活力在銅離子濃度為0.69 mg/L時最高，與其他試驗組有顯著差異（P＜0.05）。濃度為0.17、2.77和11.08 mg/L的試驗組與對照無顯著差異。不同濃度的試驗組，Ca2+-ATP酶活力在5和10 d無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 CuSO4·5H2O暴露下中華絨螯蟹鰓 Ca2+-ATP酶活力

2.3 鰓NaK-ATPase基因表達情況

由圖3可以看出：當中華絨螯蟹暴露5 d時，隨著銅離子濃度的升高，NaK-ATPase基因的表達量呈現先升高后下降的趨勢，并且在銅離子濃度為0.69 mg/L時表達量最高。NaK-ATPase基因的表達量在銅離子濃度為0.17、0.69、2.77和11.08 mg/L時，試驗組的表達量均顯著高于對照組的（P＜0.05）。10 d時，NaK-ATPase基因的表達量也呈現出先升高后下降的趨勢，當銅離子濃度為0.17、0.69 mg/L時，顯著高于其他組的（P＜0.05）。4個不同濃度的試驗組，中華絨螯蟹暴露5和10 d的NaKATPase基因的表達量差異性顯著（P＜0.05），且5 d的NaK-ATPase基因表達量大于10 d的。

圖3 CuSO4·5H2O暴露下中華絨螯蟹鰓 NaK-ATPase基因的表達量

2.4 鰓V-ATPase基因的表達情況

由圖4可以看出：當中華絨螯蟹暴露5 d時，V-ATPase基因的表達量在濃度為0.17 mg/L時最高、0.69 mg/L次之，且顯著高于對照組；當濃度為2.77和11.08 mg/L時，試驗組的表達量顯著低于對照組的（P＜0.05）。10 d時，V-ATPase基因的表達量在濃度為0.17和0.67mg/L時較高，與其他試驗組存在顯著差異（P＜0.05）；當濃度為2.77 mg/L時，表達量與對照組無顯著差異（P＞0.05）；當濃度為11.08 mg/L時，表達量低于對照組的（P＜0.05）。中華絨螯蟹暴露5和10 d的V-ATPase基因表達量均呈現出先升高后下降的趨勢。在4個不同濃度的試驗組中，當濃度為0.17和0.69mg/L時，中華絨螯蟹暴露5和10 d的V-ATPase基因表達量差異性顯著（P＜0.05），且5 d的V-ATPase基因表達量大于10 d的。

圖4 CuSO4·5H2O暴露下中華絨螯蟹鰓 V-ATPase基因的表達量

2.5 鰓NKCC基因的表達情況

由圖5可以看出：當中華絨螯蟹暴露5 d時，銅離子暴露組的NKCC基因表達量升高，且隨著銅離子濃度的升高，NKCC基因的表達量基本上呈現先升高后下降的趨勢。在濃度為0.69、2.77、11.08 mg/L時，試驗組的表達量顯著高于對照組的（P＜0.05）。10 d時，濃度為0.17、0.69、2.77mg/L時，試驗組的基因表達量低于對照組的，且差異顯著（P＜0.05）。

圖5 CuSO4·5H2O暴露下中華絨螯蟹鰓 NKCC基因的表達量

3 討論

3.1 銅對中華絨螯蟹鰓ATP酶活性的影響

Na+/K+-ATP酶鑲嵌于脂質磷脂雙分子層，不僅可以催化生物體內的ATP水解，還可以為Na+和K+的主動運輸提供能量，維持細胞內高K+低Na+和細胞外高Na+低K+的狀態［16］。中華絨螯蟹鰓組織中Na+/K+-ATP酶位于鰓表皮離子轉運細胞膜的內側，其活性被抑制會影響鰓的滲透壓和離子轉運的功能，破壞中華絨螯蟹體內滲透壓的平衡［17］。Morgan等［18］研究發現，虹鱒暴露于含銀的溶液8 h，Na+和K+的流入被100%抑制，鰓的滲透調節作用被嚴重干擾。本研究結果表明，當銅離子暴露5和10 d時，隨著暴露濃度的增加，Na+/K+-ATP酶活性呈現出先升高后下降的趨勢。當CuSO4·5H2O濃度為0.69 mg/L時，Na+/K+-ATP酶活性最大；當濃度為2.77、11.08mg/L時，Na+/K+-ATP酶活力下降。這表明銅濃度≤0.69 mg/L可以提高中華絨螯蟹鰓組織中的Na+/K+-ATP酶活性，高濃度的銅離子抑制Na+/K+-ATP酶活性。高春生等［19］研究發現，低濃度Cu2+（離子濃度＜0.30 mg/L）暴露，對黃河鯉組織Na+/K+-ATP酶活性具有促進作用，高濃度Cu2+（離子濃度＞0.30 mg/L）對黃河鯉Na+/K+-ATP酶活性具有抑制作用。高濃度銅離子能夠抑制Na+/K+-ATP酶活性，可能是由于細胞內積累了一定劑量的銅離子，造成細胞膜脂質過氧化，同時，銅離子與膜上蛋白質的結合位點作用引起蛋白質空間構象發生變化，阻止了底物與蛋白質的結合，從而抑制了ATP酶的活性，導致Na+/K+-ATP酶活性下降［20-22］。

Ca2+在信號傳導中有重要作用，可調節細胞的各種生理功能。Ca2+-ATP酶位于細胞膜和細胞器膜上，利用ATP提供能量，將細胞質Ca2+主動轉運至細胞外或細胞器內，減輕過量Ca2+對細胞的毒害。吳婷婷等［24-25］研究發現，鉛離子、鎘離子能引起胞內Ca2+濃度的增加，進而引起Ca2+-ATP酶活性的增加。當生物體處在缺氧、毒物的環境因素作用下，程度嚴重時，細胞膜會受到損傷進而導致細胞內的ATP缺乏，細胞質內Ca2+平衡遭到破壞，引起細胞凋亡、損傷甚至死亡［23］。本研究發現：試驗暴露5 d時，銅離子濃度為0.17 mg/L的試驗組Ca2+-ATP酶活力變化不明顯；當濃度升高至0.69 mg/L時，Ca2+-ATP酶活性最高，胞漿內離子濃度升高。說明銅離子的刺激，可能導致細胞質內Ca2+含量的增加，刺激Ca2+-ATP酶活性升高，將細胞質內Ca2+泵出細胞或泵入細胞器，是維持細胞內Ca2+穩態的一種補償機制［23］。當銅離子濃度為2.77和11.08 mg/L時，其鰓組織Ca2+-ATP酶活性出現了明顯的下降。高濃度銅離子可能導致細胞損傷，進而導致Ca2+-ATP酶活性被抑制。試驗暴露5和10 d時，Ca2+-ATP酶活性無顯著性差異，表明銅離子暴露時間的延長對中華絨螯蟹鰓組織Ca2+-ATP酶活性的影響不大。

3.2 中華絨螯蟹鰓離子轉運酶相關基因的表達量

本研究結果顯示，當銅離子暴露5和10 d時，編碼Na+/K+-ATP酶的基因NaK-ATPase表達量隨著銅離子濃度的增加表現出先上升后下降的趨勢，在濃度為0.69 mg/L時達到最大值，與ATP酶的活性一致，這表明銅離子脅迫使水體中離子濃度增大，為了維持機體離子平衡，Na+/K+-ATP酶活性增強，NaK-ATPase基因的表達量隨之增多。銅離子濃度升高會產生細胞毒性，導致不能維持機體的滲透壓平衡，離子轉運受阻，抑制了Na+/K+-ATP酶活性以及NaK-ATPase基因的表達量。4個不同濃度的試驗組脅迫5 d時，Na+/K+-ATP酶活性比脅迫10 d的高，NaK-ATPase基因的表達量也呈現相似現象，這表明中華絨螯蟹鰓Na+/K+-ATP酶活性還受銅離子脅迫時間的影響，脅迫時間越長，Na+/K+-ATP酶活性受抑制的程度越大，進而說明銅離子對中華絨螯蟹Na+/K+-ATP酶活的影響具有時間效應。同時，其他重金屬離子如Cd2+、Zn2+等對甲殼類動物Na+/K+-ATP酶活性的抑制也具有劑量效應和時間效應［27-28］。

V-ATP酶是一種多亞基的質子泵，通過泵出H+產生膜內外電勢差，使Na+通過Na+/H+交換器進入膜內［29］。當銅處理濃度為0.17、0.69mg/L時，V-ATPase基因的表達量顯著高于對照組的，說明此濃度的銅離子能夠激活該基因的表達；當銅離子濃度為2.77、11.08mg/L時，V-ATPase基因的表達量顯著低于對照組的，說明高濃度銅離子會抑制該基因的表達。銅脅迫10 d時，V-ATPase基因的表達量比5 d的有所降低。研究表明，縊蟶的V-ATPase在低鹽和高鹽度環境下參與滲透調節和離子轉運過程［30］。本研究中，銅離子對V-ATPase基因表達的影響具有劑量效應和時間效應。

NKCC能以1Na+∶1K+∶2Cl-的比例對組織中的離子進行跨膜轉運，在細胞滲透壓調節、維持離子平衡、調節細胞體積等方面發揮了重要作用［31］。廖雅麗等［32］研究表明，魚體處于高滲環境下，機體NKCC被激活，向體外分泌離子，維持滲透壓平衡。本研究發現，試驗暴露5 d時，NKCC基因的表達量先上升后下降，在銅離子濃度為0.69 mg/L時達到最高。銅離子脅迫剛開始時，中華絨螯蟹外界水環境中的銅離子濃度升高，細胞滲透壓增高，中華絨螯蟹啟動機體的滲透壓調節機制，NKCC基因的表達量上升。隨著銅離子濃度的增大，NKCC基因的表達受到了抑制。試驗暴露10 d時，銅離子濃度為0.17、0.69和2.77mg/L時，NKCC基因的表達量均比對照組的低，說明長時間的銅離子脅迫抑制了NKCC基因的表達。

綜上，銅離子暴露影響了中華絨螯蟹鰓一系列離子轉運酶的活性和基因表達水平，并且具有劑量效應和時間效應。低濃度銅離子能夠提高中華絨螯蟹鰓ATP酶活性和基因表達水平，高濃度銅離子可抑制中華絨螯蟹鰓ATP酶活性和基因表達水平，并且隨著暴露時間的延長，酶活性和基因表達水平呈下降趨勢。