柱前甲基衍生化GC-MS法測定人糞便短鏈脂肪酸

常滿，李曉飛，何芍瑩，賀炳凱，范輝

（廣東省代謝病中西醫結合研究中心/糖脂代謝病教育部重點實驗室/國家中醫藥管理局高脂血癥調肝降脂重點研究室/廣東藥科大學中醫藥研究院/廣東省代謝性疾病中醫藥防治重點實驗室，廣東 廣州 510006）

短鏈脂肪酸（SCFAs）是由腸道微生物代謝產生、少于7個碳原子的一類有機脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸[1]。人體糞便樣品中的SCFAs 以乙酸、丙酸和丁酸為主[2-3]。研究表明，SCFAs是一種重要的信號分子，可與其特異性受體相互作用[4]，對腸道有氧化、維持水電解質平衡、調節腸道菌群平衡、改善腸道功能、抗炎、抗腫瘤和調控基因表達等重要作用；在多個水平上影響糖脂質代謝，既參與脂肪的合成又有一定程度抑制作用；作為腸道菌群重要的代謝物，SCFAs可通過對多個系統的影響，協同發揮其廣泛生理作用，提高機體抗病力，維護機體健康[5-10]。

SCFAs為揮發性脂肪酸，易逸失，直接測定難度大，測定方法多采用高效液相色譜法、氣相色譜法等[11]。現有文獻報道糞便類樣本的SCFAs 測定方法，樣品前處理復雜，干擾峰多，靈敏度不高[12]。本研究收集人的糞便樣品，建立一種新穎的柱前甲基衍生化GC-MS 技術對糞便樣本中的SCFAs 進行定性定量分析，擬為腸道菌群功能的相關研究提供依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B-5977B GC-MS 氣相色譜質譜儀（安捷倫科技有限公司）；DB-23 色譜柱（安捷倫科技有限公司）；5180R 低溫高速離心機（Eppendorf 公司）；Vortex-3 漩渦混合器（德國IKA 公司）；BT2245 電子天平（德國sartorius）；BCD-266CM -80 ℃冰箱（美的集團有限公司）。

對照品乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸均購于德國DR 公司（批號分別為CDCT-C10015500、CDCTC16493000、CDCT-C14395500、CDCT-C14479470）；丁酸（批號CDDE-N-4-A-1GM，NU-CHEK 公司）；戊酸（批號CDAE-75054-1ML，Sigma 公司）；4-甲基戊酸（批號M813962，麥克林Macklin 公司）；甲醇（色譜純，批號M813962，德國Merck 公司）；3-（三氟甲基）苯基三甲基氫氧化銨5% 甲醇溶液（批號IH0096-0，TCI 公司）；三氯甲烷（分析純，麥克林公司）；濃硫酸（分析純，廣州化學試劑廠）；超純水（生物級，屈臣氏蒸餾水公司）。

1.2 溶液的制備

1.2.1 糞便收集 招募健康志愿者，受試者在開展受試前簽署書面通知書并完成倫理審批。采樣前備好干冰及冰盒，無菌杯采集新鮮糞便，糞樣收集后，迅速放入干冰盒中冷凍。完成采樣后，將樣本立即凍存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 混合對照品溶液的制備 精密量取4-甲基戊酸內標物適量置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋，配制成內標溶液（4-甲基戊酸0.42 mmoL/L）。精密量取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸短鏈脂肪酸對照品，置5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋制成短鏈脂肪酸對照品混合儲備液（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸濃度分別為36.00、14.40、14.40、14.40、12.00、12.00 mmoL/L）。再精密量取各混合儲備液1.0 mL 于2.0 mL 或5.0 mL 容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，依次制備成不同濃度的混合對照品溶液，見表1。

表1 混合對照品溶液的濃度Table 1 Concentration of mixed reference substancec/（mmoL·L-1）

精密量取各混合對照品溶液100 μL 于EP 管中，精密加入內標溶液100 μL，再精密加入100 μL衍生化試劑3-（三氟甲基）苯基三甲基氫氧化銨（5%甲醇溶液），用封口膜封口，充分混勻后，常溫下靜置反應60 min，完成后即可上樣檢測（甲基化反應）。

1.2.3 糞便供試品溶液的制備 精密稱取150 mg糞便樣本，加入500 μL 三氯甲烷濃硫酸溶液（取適量的三氯甲烷于50 mL離心管中，緩慢加入濃硫酸，調節其pH 值至2.0～3.0），渦旋10 min，充分混勻，冰上靜置5 min，12 000 r/min 下離心10 min，取下清液于1 mL EP 管中，再次12 000 r/min 下離心5 min。取上述兩次離心后的下清液100 μL，精密加入內標溶液100 μL，最后精密加入3-（三氟甲基）苯基三甲基氫氧化銨（5%甲醇溶液）試劑100 μL，用封口膜封口，常溫靜置反應60 min，即為糞便供試品溶液。

1.3 測定條件

色譜條件：色譜柱DB-23 石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃，分流比10∶1，進樣量1.0 μL，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min。升溫程序：初始溫度40 ℃保持0.5 min，58 ℃保持3 min，70 ℃保持2 min，120 ℃保持1 min，最后240 ℃保持10 min，總運行36.5 min，見表2。

表2 氣相色譜升溫條件Table 2 Gas chromatography heating conditions

質譜條件：EI離子源；離子源溫度：230 ℃；電子轟擊能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；溶劑延遲時間4.5 min；采用選擇離子掃描方式（掃描范圍m/z：40～500）。

2 結果

2.1 系統適應性試驗

在上述色譜質譜條件下，混合對照品溶液、糞便樣品溶液的6 種短鏈脂肪酸、內標物實現完全分離，根據總離子流圖（圖1）和成分質譜圖（圖2）可以確定衍生化短鏈脂肪酸的各組分定性、定量離子（表3）。

表3 7種化合物的定性、定量離子Table 3 Qualitative and quantitative ions of seven compounds

圖1 混合對照品溶液（a）和糞便供試品溶液（b）的總離子流圖Figure 1 Total ion chromatograms of the mixed standard solution（a）and the fecal sample solution（b）

圖2 供試品中主要成分質譜圖Figure 2 Mass spectrograms of main components in the sample

2.2 線性關系

取配置好的混合對照品溶液，按“1.2.2”項下方法發生甲基化反應后，按“1.3”項下色譜質譜條件進樣測定，用加權最小二乘法作線性回歸，得回歸方程。進樣分析得到6 種化合物相應的標準方程，以待測物峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標（Y），待測物濃度（mmoL/L）為橫坐標（X），進行加權最小二乘法作線性回歸，得各化合物線性方程，結果顯示相關系數均r>0.999，各化合物線性范圍內線性關系均良好，見表4。以信噪比10∶1 確定各化合物的方法結果定量下限均達到0.1 μmoL/L，靈敏度高。

2.3 精密度、重復性及穩定性試驗

取中間濃度（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸濃度分別為1.5、0.6、0.6、0.6、0.5、0.5 mmoL/L）混合對照品溶液濃度連續進樣6 次分析，結果顯示各短鏈脂肪酸的峰面積RSD值均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

取同一糞便樣品6份按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣分析平行6份相同糞便樣品中，結果顯示各短鏈脂肪酸的含量RSD值均小于5.0%，表明方法重復性好。

取同一糞便樣品按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液后，于0、2、4、6、8、12、24 h 進樣測定，結果顯示樣本中24 h內6種短鏈脂肪酸的含量RSD值均小于8.0%，表明供試品溶在室溫下24 h穩定性良好。

以上結果均符合生物樣本檢測的基本要求，見表4。

表4 線性關系、精密度、重復性及穩定性考察結果Table 4 Results of linear relationship,precision,repeat ability and stability

2.4 加樣回收率試驗

取已知濃度的同一糞便樣品75 mg，分別加入約相當于樣品質量的混合對照品溶液，各對照品加入量按80%、100%、120%的低、中、高3 種濃度組配置，每組平行制備3份樣品，按“1.2.3”項方法處理樣本后，按“1.3”項色譜、質譜條件檢測各樣品中SC‐FAs 的含量，計算回收率及RSD 值，見表5。結果顯示，樣本中各個SCFAs 測得的RSD 大部分小于10.0%，表明方法的提取回收率良好，符合生物樣本檢測的要求。

表5 糞便中SCFAs提取回收率Table 5 Recovery rate of SCFAs extraction from feces(n=3)

2.5 樣品中短鏈脂肪酸的含量測定

收集糞便后，按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.3”項色譜、質譜條件進樣測定各個化合物的峰面積后，代入表4的回歸方程進行計算，得出各脂肪酸的濃度見表6。

表6 短鏈脂肪酸的測定Table 6 Determination of short-chain fatty acids(n=3)

3 討論

目前，GC法、GC-MS法分析脂肪酸時采用的柱前衍生法多為甲酯化法[13]。甲酯化法使羧基與醇羥基酯化反應生成相應的脂肪酸甲酯，通常采用酸催化（濃硫酸）、堿催化（氫氧化鉀）進行酯化反應。濃硫酸催化產物多，影響成分分離，且過量硫酸需要氮氣吹干，步驟提取程序復雜。堿催化甲酯化法不適合游離型脂肪酸，適合甘油三酯型脂肪酸[13]。三氟化硼催化法[14-16]，存在步驟繁瑣，加標回收率低，溶液毒性較強，易于揮發，加熱時易變成毒性更大的氟化氫等有害物質的缺點。

本研究對樣品的前處理方法進行了考察，比較了乙酸乙酯、正己烷、乙醚、三氯甲烷與50%濃硫酸按1∶10的比例混合作為有機提取溶劑的效果，結果發現：使用乙酸乙酯提取時，溶劑會與組分乙酸出現共流出峰現象；使用正己烷提取時，提取率比三氯甲烷低，色譜峰峰形不理想；使用乙醚時，揮發性較強，導致樣本定量結果不穩定；而使用三氯甲烷作提取溶劑時，提取效率較高，且處理后可得到比較澄清的樣本，雜質較少，峰形較好。綜合考慮，選用三氯甲烷加50%濃硫酸按照1∶10比例混合，作為糞便產物的提取試劑。

本研究采用的3-（三氟甲基）苯基三甲基氫氧化銨（TMTFTH）的成酯反應是一種熱裂解的甲基化反應所生成的脂肪酸甲酯，反應原理見圖3。該反應屬于烷基化反應，TMTFTH 是季胺堿，化學反應包含兩個連續的過程：第一步是在季胺堿的作用下，脂肪酸羧基去質子，與季胺堿形成相應的季胺鹽，這一過程反應產物為有機酸有機堿鹽，物質穩定，決定了方法的穩定；第二步是上述季胺鹽在氣相色譜進樣口處進一步熱分解成三甲基叔胺和相應的羧酸甲酯衍生物，該反應屬于陰離子的親核反應，這一步反應在氣相色譜進樣口溫度250 ℃的條件下，瞬間分解為易揮發的羧基甲酯。熱裂解的甲基化反應雖然生成的是羧基甲酯，但反應原理不同于酯化反應。熱裂解的甲基化反應省去萃取、氮吹、蒸發等復雜步驟，加樣反應后離心，取下清液即為待測液。該方法較好地解決了短鏈脂肪酸分析中存在的易逸失、衍生化反應不完全、提取步驟復雜等瓶頸問題。

圖3 柱前甲基化反應原理Figure 3 Principle of pre-column methylation reaction

本研究建立了一種柱前甲基衍生化GC-MS 法測定人糞便短鏈脂肪酸的方法，利用GC-MS聯用法對微量樣品的檢測優勢，改進衍生化方法，以濃硫酸水解，減少離心次數，梯度洗脫增強靈敏性。該方法操作簡便、快速、靈敏，且樣品前處理簡單、反應原理新穎、切實可行，適用于人糞便樣本中短鏈脂肪酸含量的檢測，為提升腸道菌群功能的科學研究奠定了基礎。