銀杏葉提取物對球囊損傷后大鼠頸動脈內膜增生致再狹窄的影響

徐鵬，馬珂，岳永強

（鄭州大學第一附屬醫院腔內血管外科，河南 鄭州 450000）

頸動脈狹窄是臨床常見的血管類疾病，多發于60 歲以上人群，以發病率高、并發癥多為主要特征，可誘發腦部缺血、局部神經功能一過性喪失，嚴重時可引發缺血性腦卒中，危及患者生命[1]。頸動脈支架成形術（carotidarterystenting,CAS）是頸動脈狹窄最常用的治療手段，可有效提升血流通暢度，維持大腦血液循環，但其術后易發生血管再狹窄，大大提高了致殘率及病死率[2]。近年來隨著藥物洗脫支架、激光內照射等新興技術的應用，一定程度上降低了CAS 術后短期再狹窄率，但其安全性及遠期預后仍未得到驗證，依然是臨床醫生面臨的重大難題之一。銀杏葉提取物是自中藥銀杏葉中提取的混合物，具有抗氧化、抗炎、抗血小板及神經保護等藥理作用[3]。近年來有學者認為[4]，銀杏葉提取物可減少小鼠主動脈瓣組織鈣沉積，降低其鈣含量，從而減輕華法林誘導的主動脈瓣鈣化。然而，目前關于其對CAS 術后再狹窄的緩解作用鮮有報道，且缺乏對應的機制研究。大鼠頸總動脈球囊損傷模型是模擬CAS 術后再狹窄的經典模型，本研究通過建立該模型，觀察銀杏葉提取物對球囊損傷后大鼠頸動脈再狹窄的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50 只SD 大鼠，SPF 級，雄性，8 周齡，體質量（300±20）g，上海吉輝實驗動物飼養有限公司，生產許可證號SCXK（滬）2017-0012。

1.2 藥物、主要試劑、儀器

銀杏葉提取物（質量分數98%）、核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路激活劑佛波酯（上海滬崢生物科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、一氧化氮（NO）試劑盒（上海研生實業有限公司）；兔抗大鼠增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、NF-κB p65、p-NF-κB p65、胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、p-ERK1/2 一抗[艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司]。GENios 酶標儀（瑞士Tecan 公司）；SZ2 顯微鏡（日本Nikon株式會社）。

1.3 頸總動脈球囊損傷模型的建立[5]

大鼠適應性飼養1 周后開始復制模型，禁食禁水12 h，背部皮下注射低分子肝素預防急性血栓，12 h 后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于手術臺，備皮消毒后沿頸部正中線切開皮膚，分離左頸主動脈、頸外動脈及頸內動脈，動脈夾夾閉主動脈近心端及頸內動脈，結扎頸外動脈遠心端，并于近心端做剪口，將2F球囊導管由剪口處插入頸動脈3 cm，球囊給壓4ATM，緩慢泄壓抽動導管，重復3次后撤出球囊，動脈夾撤出，觀察到頸主動脈、頸內動脈恢復搏動則表明模型復制成功，后封閉切口。術后24 h 皮下注射低分子肝素，腹腔注射15 萬u/kg青霉素防止感染，每日1次，連續3 d。

1.4 干預方式[6-7]

40 只大鼠復制模型，剔除中途死亡10 只，成功30 只，隨機數字法分為模型組、銀杏葉組、銀杏葉+佛波酯組，每組各10 只。另取10 只大鼠僅僅分離左頸外動脈并結扎，設為假手術組。銀杏葉+佛波酯組灌胃銀杏葉提取物生理鹽水溶液（含銀杏葉提取物100 mg/kg），2 h 后皮下注射佛波酯（1 μg/只）；銀杏葉組灌胃銀杏葉提取物生理鹽水溶液（含銀杏葉提取物100 mg/kg），皮下注射等量生理鹽水；假手術組、模型組灌胃等量生理鹽水，皮下注射等量生理鹽水。每日1 次，干預14 d。干預期間測量體質量并觀察大鼠飲水、精神狀態及毛發等一般情況。

1.5 組織取材

末次干預次日，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采集腹主動脈血，低溫離心機分離出血清，置于4 ℃冰箱冷藏保存；取血后脊椎脫臼處死大鼠，剝離左頸動脈，切取球囊損傷段，分成2份，一份投入4%（φ）多聚甲醛中固定24 h，經脫水、透明、浸蠟、包埋，病理切片機切為4 μm 厚度切片用于免疫組化染色及HE 染色，另一份置于-80 ℃冰箱冷凍保存，用于組織蛋白檢測。

1.6 檢測血清炎癥因子水平

取冷藏保存的腹主動脈血清，經ELISA 法檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6 水平，按照試劑盒說明書要求操作實驗步驟，經酶標儀測定波長570 nm位置吸光度（A）值，繪出標準曲線計算TNF-α、IL-6濃度。

1.7 檢測血清MCP-1、NO水平

取冷藏保存的腹主動脈血清，經ELISA 法檢測血清MCP-1、NO 水平，按照試劑盒說明書要求操作實驗步驟，經酶標儀測定波長450 nm 位置吸光度（A）值，繪出標準曲線計算MCP-1、NO濃度。

1.8 免疫組化法檢測頸動脈血管PCNA陽性表達

取頸主動脈組織切片，脫蠟至水后滴加檸檬酸鹽緩沖液，微波加熱修復抗原，冷卻后PBS 沖洗，滴加3%H2O2避光保存20 min，PBS 沖洗，加入山羊血清常溫孵育20 min，吸棄血清，加入兔抗大鼠PCNA一抗（1∶300），移至黑暗濕盒內冰箱冷藏過夜，PBS沖洗，加入二抗，37 ℃孵育1 h，PBS 沖洗后滴加DAB 顯色液，蒸餾水沖洗后，滴入中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察PCNA 陽性表達。棕色細胞即為PCNA 陽性細胞，計算陽性細胞率=棕色細胞數/總細胞總數×100%。隨機選取5 個不相鄰均勻視野計數，取其均值。

1.9 HE染色觀察頸總動脈內膜增生及管腔狹窄程度

取頸主動脈組織切片，脫蠟至水后，蒸餾水沖洗，投至蘇木素溶液染色5 min，蒸餾水沖洗，滴加1%鹽酸酒精分化，碳酸氫鈉溶液漂洗，伊紅液二次染色2 min，常規脫水、透明后，中性樹脂封片，光鏡下觀察頸總動脈組織橫切面病理變化并拍照記錄，經Image J 軟件測量外膜內區、內膜內區及管腔面積，計算內膜增生率=（內膜內區面積-管腔面積）/（外膜內區面積-內膜內區面積）×100%，管腔狹窄指數=管腔面積/內膜內區面積。

1.10 Western blot法檢測頸總動脈組織NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達

取冷凍保存的頸總動脈組織，剪碎后放入研磨器充分研磨，PBS勻漿，加入預冷RIPA裂解液，注入離心管內，低溫離心10 min（10 000 r/min，r=15 cm），取其上清，BCA 法測定總蛋白并定量。取40 μg 待測樣本，混合5×SDS 上樣緩沖液，金屬浴沸騰變性蛋白，電泳分離后轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2 一抗（1∶500），4 ℃冰箱冷藏過夜，TBST 洗膜，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗膜，混合ECL 發光液，曝光、顯影，經成像分析儀掃描并分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參蛋白，分析NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達水平，并計算p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2。

1.11 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計軟件，計量資料以表示，多樣本資料比較采用單因素方差分析，LSD-t進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況

假手術組大鼠體質量穩定，飲水量正常，精神佳且毛發光亮；模型組大鼠體質量明顯降低，飲水量減少，精神不佳且毛發雜亂無光；銀杏葉+佛波酯組大鼠體質量降低，飲水量正常，精神一般，毛發整齊暗淡，銀杏葉組大鼠一般情況較銀杏葉+佛波酯組改善更佳。

2.2 大鼠血清TNF-α、IL-6水平

與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高（P<0.05）；與模型組比較，銀杏葉組大鼠血清TNF-α、IL-6水平降低（P<0.05）；與銀杏葉組比較，銀杏葉+佛波酯組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平升高（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較Table 1 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels of rats in each group(±s,n=10)ρ/（ng·L-1）

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較Table 1 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels of rats in each group(±s,n=10)ρ/（ng·L-1）

與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與銀杏葉組比較：@P<0.05。

組別假手術組模型組銀杏葉組銀杏葉+佛波酯組TNF-α 66.77±8.01 223.56±23.35*94.04±11.06#147.61±12.77@IL-6 54.42±6.38 168.46±18.17*73.76±8.06#131.26±17.27@

2.3 大鼠血清MCP-1、NO水平

與假手術組比較，模型組大鼠血清MCP-1 水平升高，NO 水平降低（P<0.05）；與模型組比較，銀杏葉組大鼠血清MCP-1 水平降低，NO 水平升高（P<0.05）；與銀杏葉組比較，銀杏葉+佛波酯組大鼠血清MCP-1水平升高，NO水平降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清MCP-1、NO水平比較Table 2 Comparison of serum MCP-1 and NO levels of rats in each group(±s,n=10)

表2 各組大鼠血清MCP-1、NO水平比較Table 2 Comparison of serum MCP-1 and NO levels of rats in each group(±s,n=10)

與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與銀杏葉組比較：@P<0.05。

組別假手術組模型組銀杏葉組銀杏葉+佛波酯組ρ（MCP-1）/（pg·mL-1）41.57±5.58 116.55±12.56*47.57±5.39#70.07±8.85@c（NO）/（μmol·L-1）23.45±2.42 5.17±0.49*19.60±1.34#10.30±1.24@

2.4 大鼠頸動脈血管PCNA陽性率

免疫組化染色顯示，假手術組PCNA表達較少，模型組PCNA表達顯著增加，相較于模型組，銀杏葉組及銀杏葉+佛波酯組PCNA 表達有所減少。假手術組、模型組、銀杏葉組、銀杏葉+佛波酯組頸動脈血管PCNA 陽性率分別為（6.81±0.84）%、（58.36±7.49）%、（20.99±2.43）%、（31.78±4.18）%。與假手術組比較，模型組PCNA 陽性率升高（P<0.05）；與模型組比較，銀杏葉組PCNA 陽性率降低（P<0.05）；與銀杏葉組比較，銀杏葉+佛波酯組大鼠血清PCNA陽性率升高（P<0.05）。見圖1。

圖1 頸動脈血管PCNA陽性細胞（免疫組化染色，400×）Figure 1 PCNA-positive cells in carotid artery（immunohistochemical staining，400×）

2.5 大鼠頸總動脈內膜增生率及管腔狹窄指數

假手術組頸總動脈血管管壁結構清晰、完整，未觀察到增生及管腔狹窄；模型組內彈力板破裂，從正常波浪狀轉變為平坦無彈性，內膜表面有少量紅細胞，中膜層平滑肌細胞排列紊亂，外膜層結締組織排列松散，管腔面積縮小；銀杏葉組、銀杏葉+佛波酯組上述變化較模型組有所改善，其中銀杏葉組改善程度更為明顯。見圖2。與假手術組比較，模型組頸總動脈內膜增生率升高，管腔狹窄指數降低（P<0.05）；與模型組比較，銀杏葉組頸總動脈內膜增生率降低，管腔狹窄指數升高（P<0.05）；與銀杏葉組比較，銀杏葉+佛波酯組頸總動脈內膜增生率升高，管腔狹窄指數降低（P<0.05）。見表3。

圖2 頸總動脈內膜及管腔（HE染色，40×）Figure 2 Common carotid artery intima and lumen（HE staining,40×）

表3 各組大鼠頸總動脈內膜增生率及管腔狹窄指數比較Table 3 Comparison of intimal hyperplasia rate and lumen stenosis index of common carotid artery in rats of each group(±s,n=10)

表3 各組大鼠頸總動脈內膜增生率及管腔狹窄指數比較Table 3 Comparison of intimal hyperplasia rate and lumen stenosis index of common carotid artery in rats of each group(±s,n=10)

與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與銀杏葉組比較：@P<0.05。

組別假手術組模型組銀杏葉組銀杏葉+佛波酯組內膜增生率/%6.48±0.75 139.20±16.53*15.05±1.37#42.41±5.80@管腔狹窄指數0.90±0.06 0.43±0.05*0.75±0.09#0.64±0.07@

2.6 大鼠頸總動脈組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2的表達

與假手術組比較，模型組頸總動脈組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2 升高（P<0.05）；與模型組比較，銀杏葉組頸總動脈組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2 降低（P<0.05）；與銀杏葉組比較，銀杏葉+佛波酯組頸總動脈組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2升高（P<0.05）。見表4，圖3。

圖3 頸總動脈組織NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達量Figure 3 Expression of NF-κB p65, p-NF-κB p65,ERK1/2 and p-ERK1/2 in common carotid artery tissue

表4 各組大鼠頸總動脈組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2比較Table 4 Comparison of p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-ERK1/2/ERK1/2 in common carotid artery tissue of rats in each group(±s,n=10)

表4 各組大鼠頸總動脈組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2比較Table 4 Comparison of p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-ERK1/2/ERK1/2 in common carotid artery tissue of rats in each group(±s,n=10)

與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與銀杏葉組比較：@P<0.05。

組別假手術組模型組銀杏葉組銀杏葉+佛波酯組p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.10±0.01 0.88±0.09*0.22±0.02#0.30±0.04@p-ERK1/2/ERK1/2 0.11±0.01 0.81±0.10*0.30±0.03#0.44±0.05@

3 討論

頸動脈狹窄是由頸動脈粥樣斑塊造成頸動脈管腔狹窄，從而引發的腦缺血疾病，常發于頸內動脈起始段及頸總動脈分叉，發病始于血管內膜平滑肌細胞、巨噬細胞異常聚集，膠原、脂質及彈力纖維等基質增加，平滑肌細胞隨之增生，動脈逐漸鈣化，彈性減低、管腔變窄，從而阻礙血液流動[8]。CAS 治療可通過機械擠壓擴大動脈粥樣硬化狹窄段，撕裂粥樣硬化斑塊，重塑為新的平滑內腔，其過程可損傷動脈內壁，術后再狹窄則是血管對內壁損傷過度修復的結果。高齡、合并高血壓、合并高血脂、合并糖尿病及術前狹窄程度高是CAS 術后再狹窄的主要危險因素，血管內膜異常增生被認為是其發生的主要病理機制[9]。動脈內壁損傷后平滑肌細胞亦大量增殖、分裂，細胞外基質隨之合成積聚，增殖抑制因子合成減少，內皮細胞受損后釋放大量炎癥因子，繼發反應進一步促進平滑肌細胞異常增生并遷移至受損部位，動脈血管內膜代償性增粗重塑，管腔比例及形狀改變，導致再狹窄發生[10]。因此，抑制血管內膜異常增生是治療CAS術后再狹窄的關鍵。

MCP-1 是由單核細胞及巨噬細胞分泌一種趨化因子，具有雙向調節作用，可在機體損傷后與血管受體結合，發揮其抵御輕度損傷的作用，但其亦可加劇動脈粥樣硬化發展，促進平滑肌細胞增殖及內膜組織增生，其水平升高代表動脈粥樣硬化加劇及CAS 術后再狹窄風險增加[11]。NO 是內皮細胞分泌的一種抑制增生因子，可升高細胞內環磷酸鳥苷水平，從而抑制細胞增殖[12]。PCNA 是細胞增殖所需的重要核蛋白，其表達水平與DNA復制效率呈正相關，可用于判斷細胞增殖活性高低[13]。中醫認為CAS 術后再狹窄是一種醫源性疾病，患者正氣虧虛、腑臟衰退，以致瘀血阻滯、血脈不通，CAS 術乃破血逐瘀之法，雖消瘀通痹、疏通脈絡，但過度擴張亦損脈絡，氣血未得正常灌注，瘀血內阻，血瘀之證復始，故應以益氣活血、化瘀通絡為主[14]。銀杏葉取自銀杏科植物銀杏干燥葉，可活血、止痛、化瘀，含有銀杏黃酮甙及銀杏苦內酯，二者可協同消除血管壁沉積，增加血流量，抑制紅細胞聚集凝固，從而保護心腦血管[15]。姚海艇等[16]研究認為，銀杏葉提取物聯合辛伐他汀可有效改善血脂代謝異常，縮小粥樣硬化斑塊，從而對頸動脈狹窄產生治療作用，提示銀杏葉提取物或可作為動脈粥樣硬化輔助治療推廣藥物。本研究結果顯示，與模型組比較，銀杏葉組血清TNF-α、IL-6、MCP-1 水平，PCNA 陽性率，內膜增生率降低，血清NO 水平、管腔狹窄指數升高，提示銀杏葉提取物可抑制炎癥反應，緩解動脈粥樣硬化，抑制內膜增生，治療血管再狹窄。

NF-κB 是機體內一種多功能性轉錄因子，可與不同的基因啟動子特異性結合，調控相關基因表達，在細胞增殖、分化、遷移及炎癥反應、免疫應答等多種生物學過程中發揮重要作用，其中NF-κB p65、ERK1/2 是NF-κB 通路重要調控蛋白。靜息狀態下，NF-κB p65與另一亞基p50及其抑制蛋白結合為聚合體，在細胞質中保持非活性狀態，當其被上游細胞因子刺激后，NF-κB p65 活化解離并轉移至細胞核，級聯反應信號刺激下游ERK1/2 磷酸化，啟動多個促增殖因子轉錄，加劇內膜增生[17]。王芳等[18]研究認為，抑制NF-κB/ERK 通路可降低內膜組織增殖及侵襲能力，從而抑制子宮內膜異位癥大鼠病灶生長及腺體增生。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組頸總動脈組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2 升高，經銀杏葉提取物干預后均降低，且在銀杏葉提取物基礎上增用NF-κB 通路激活劑佛波酯可減弱銀杏葉提取物對大鼠球囊損傷后頸動脈再狹窄的治療作用，提示銀杏葉提取物可能通過介導該通路治療大鼠球囊損傷后頸動脈再狹窄。

綜上所述，銀杏葉提取物可抑制炎癥反應，緩解動脈粥樣硬化，抑制內膜增生，治療球囊損傷后頸動脈再狹窄，其作用機制可能與抑制NF-κB/ERK信號通路活性有關，為臨床該藥物的使用提供了實驗基礎。由于中藥提取物具有多靶點、多機制的特點，下一步需持續研究銀杏葉提取物治療球囊損傷后頸動脈再狹窄的可能機制，為臨床靶向藥物的開發提供更多參考靶點。