化濁解毒方對慢性腎功能衰竭大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、HGF蛋白及其mRNA表達的影響

李宗濤，魏宏宇，劉豐睿，魏 曼，高 卉，馮 忖，魏曉娜

(1.河北中醫學院研究生學院，河北 石家莊 050091； 2.河北省中醫院，河北 石家莊 050011)

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是由于各種原因引起的腎臟結構或功能破壞，主要表現為腎小球濾過率下降、代謝產物潴留、水-電解質和酸堿平衡失調、全身各系統受累等。目前，CRF的治療原則主要以積極治療原發病，避免和糾正CRF進展的危險因素，防治并發癥以及進行血液凈化為主[1]。CRF患者的腎臟病變呈進行性發展，多為不可逆。中醫藥在治療CRF方面具有豐富的經驗和明顯的療效，表現在患者臨床癥狀明顯改善、尿蛋白含量減少、腎功能惡化延緩[2]。隨著對慢性腎臟病的不斷認識，國醫大師李佃貴提出從“濁毒”論治CRF并取得一定效果。

“濁毒”既是一種致病因素，同時也是一種蘊積于體內的病理產物[3]。濁屬陰邪，濁邪多易阻滯脈絡，壅塞氣機；毒屬陽邪，性烈善變，易損害氣血營衛。濁、毒兩者常相互膠結致病，故常“濁毒”并稱。CRF的發病原因復雜，病程綿長，病邪作用于人體，極易發展為濁毒內壅，故臨床治療時當以“濁毒”論治[4]。本課題組以李佃貴的“濁毒”理論為指導，確立了化濁解毒法治療CRF的方案，總結出具有健脾補腎、化濁解毒功效的化濁解毒方(基礎方)：黃芪、炒白術、積雪草、土茯苓、水蛭、莪術、石見穿、萆薢、酒大黃、水牛角。本方可改善患者臨床癥狀，減少尿蛋白，延緩腎功能衰竭進展并有效提高患者生存質量，但其作用機制尚不明確，故本研究采用5/6腎切除法復制CRF大鼠模型，探究化濁解毒方治療CRF的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 60只SPF級SD雄性大鼠，6周齡，體質量約180 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產許可證號：SCXK(京)2016-0006]，飼養于河北中醫學院實驗動物中心動物房(相對濕度50%～70%，溫度23～25 ℃，晝夜各半)。本實驗由河北中醫學院實驗動物倫理委員會審核通過，倫理審查編號為DWLL2021118。

1.2 主要試劑 抗Actin抗體(批號 GB12001)、抗轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)抗體(批號 GB111876)、抗α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)抗體(批號 GB111364)、BCA蛋白定量檢測試劑盒(批號 G2026)、RNA提取液(批號 G3013)、Servicebio?RT First Strand cDNA分析試劑盒(批號 G3330)、2×SYBR Green qPCR反應混合物(無ROX)(批號 G3320)、PCR引物：武漢賽維爾生物科技有限公司；抗肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)抗體(批號 A1193)：ABclonal。

1.3 主要儀器 低溫型研磨儀(型號 KZ-Ⅲ-FP)：武漢賽維爾生物科技有限公司；臺式高速冷凍型微量離心機(型號 D3024R)：大龍興創實驗儀器(北京)股份公司；熒光定量PCR儀(CFX)：美國Bio-rad。

1.4 藥物 化濁解毒方(黃芪、積雪草各30 g，土茯苓20 g，炒白術、莪術、石見穿、萆薢、水牛角各15 g，酒大黃9 g，水蛭3 g)智能配方顆粒：廣州一方藥業集團有限公司；尿毒清顆粒(批號 20210404，每袋5 g)：康臣藥業有限責任公司；氯沙坦鉀(每片50 mg，批號 T030149)：杭州默沙東制藥有限公司。

2 方法

2.1 CRF大鼠模型復制與分組 將60只大鼠適應性喂養1周后，隨機選取12只作為對照組，其余大鼠作為手術組。采用5/6腎切除法[5]復制CRF模型，在10%水合氯醛麻醉下分兩次手術共切除5/6腎組織。術后2周，從手術組、對照組各隨機抽取3只大鼠，檢測血清肌酐(serum creatinine, SCr)，以SCr>53.93 μmol/L[6]作為模型復制成功的依據。隨后將手術組隨機分為化濁解毒組(11只)、尿毒清組(11只)、氯沙坦鉀組(11只)、模型組(12只)。

2.2 給藥方法 按照大鼠用藥劑量是70 kg成人臨床用藥劑量6.3倍的換算系數[7]，化濁解毒組、尿毒清組的用藥劑量分別為2.35、2.63 g/(kg·d)，氯沙坦鉀組的用藥劑量為5.25 mg/(kg·d)；對照組及模型組給予等量純凈水。連續灌胃給藥12周。

2.3 檢測指標

2.3.1 大鼠一般情況 觀察各組大鼠的活動情況、精神狀況、攝食量和飲水量、皮毛狀態、尿量、死亡數量等，并記錄體質量變化。

2.3.2 取材 給藥12周后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，從腹主動脈采血6～8 mL，置于不加任何抗凝劑的試管中靜置，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于4 ℃冰箱中保存，用于測定腎功能。采血后采用頸椎脫臼法處死大鼠，并盡快取出腎臟組織。

2.3.3 腎功能檢測 采用全自動生化分析儀檢測大鼠SCr、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。

2.3.4 腎組織形態學變化 將腎組織用4%多聚甲醛固定液充分浸泡48 h，取出，沖洗，用不同梯度的乙醇進行脫水處理，在二甲苯中透明，浸蠟，石蠟包埋固定，用切片機切成2 μm左右厚度的薄片，梯度乙醇脫水，用中性樹膠封片，蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色，光學顯微鏡下觀察腎組織形態學變化。

2.3.5 RT-PCR法檢測腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表達水平 提取各組大鼠腎臟組織總RNA，稀釋成相同濃度，以GAPDH為內參；以特異性引物反轉錄合成cDNA。程序：42℃ 15 min，85 ℃ 5 s，以cDNA為模板擴增基因片段；95 ℃ 10 min預變性，后95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環。采用2-ΔΔCT法計算各目的基因的相對表達水平。引物序列(5′→3′)：GAPDH 上游引物為CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG，下游引物為GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT；HGF上游引物為CTCCTGCTTCCTGTCACCATC，下游引物為TTTCTGATGCACCTGTTGGC；TGF-β1上游引物為CACTCCCGTGGCTTCTAGTG，下游引物為CATAGATTGCGTTGTTGCGGT；α-SMA上游引物為ACCATCGGGAATGAACGCTT，下游引物為CTGTCAGCAATGCCTGGGTA。

2.3.6 Western blot法檢測腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA蛋白表達水平 以裂解液(使用前加入蛋白酶抑制劑)提取冰凍腎組織蛋白質，并用BCA法測定其含量。將蛋白溶液按照4∶1的比例加入5倍還原型蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性15 min。經電泳、轉膜、牛奶封閉、一抗(α-SMA、HGF、TGF-β1、Actin的稀釋比例均為1∶1 000)孵育過夜、熒光二抗(1∶3 000)孵育后，TBST清洗顯影。應用Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值，并以目的蛋白與Actin灰度值的比值表示蛋白相對表達水平。

3 結果

3.1 大鼠一般情況 結束實驗時，對照組大鼠反應敏捷，皮毛密集有光澤，精力旺盛，進食、活動無明顯異常，尿量正常，體質量增長較其他組明顯。模型組大鼠精神不振，皮毛枯槁蓬松無光澤，進食、活動均減少，尿量明顯減少，體質量降低。化濁解毒組、尿毒清組、氯沙坦鉀組大鼠反應均較模型組靈敏，進食及活動量無明顯減少，尿量較模型組稍增多，體質量均有所增加，其中化濁解毒組大鼠一般情況改善較為明顯。對照組大鼠無死亡，模型組死亡4只，化濁解毒組死亡2只，尿毒清組死亡3只，氯沙坦鉀組死亡3只。

3.2 5組大鼠SCr、BUN水平比較 與對照組比較，模型組大鼠BUN、SCr水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各治療組BUN、SCr水平均顯著降低(P<0.05)；化濁解毒組BUN、SCr水平顯著低于氯沙坦鉀組及尿毒清組(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠SCr、BUN水平比較

3.3 5組大鼠腎組織病理變化比較 對照組大鼠腎小球與腎小管結構清晰，未見明顯病理變化。模型組大鼠腎臟結構異常，異常區域內腎小球消失，腎小管極度擴張，內含大量漿液樣物質，同時上皮細胞扁平化，基底膜增厚，間質內膠原纖維增生伴淋巴細胞浸潤。尿毒清組大鼠腎小球硬化，腎小管擴張，間質增生伴淋巴細胞浸潤。氯沙坦鉀組腎小球內細胞數量增多，間質增生，腎小管纖維化。化濁解毒組腎血管瘀血，間質增生伴淋巴細胞浸潤，并可見腎小管纖維化。與模型組比較，尿毒清組、氯沙坦鉀組、化濁解毒組纖維化均有不同程度減輕。見圖1。

注：A.對照組；B.模型組；C.尿毒清組；D.氯沙坦鉀組；E.化濁解毒組；示正常的腎小管和擴張的腎小管，示正常的腎小球和肥大的腎小球，示間質纖維化，示腎血管，示炎癥細胞浸潤

3.4 5組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，尿毒清組、氯沙坦鉀組和化濁解毒組大鼠腎組織 TGF-β1、α-SMA mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，HGF mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；尿毒清組、氯沙坦鉀組和化濁解毒方組大鼠腎組織 TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA

3.5 5組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組TGF-β1、HGF、α-SMA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，尿毒清組、氯沙坦鉀組和化濁解毒組腎組織TGF-β1、α-SMA表達水平顯著降低(P<0.05)，α-SMA表達水平顯著升高(P<0.05)；尿毒清組、氯沙坦鉀組和化濁解毒方組TGF-β1、HGF、α-SMA表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表3。

表3 5組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA

注：A. 對照組；B.模型組；C.尿毒清組；D.氯沙坦鉀組；E.化濁解毒組

4 討論

CRF屬于中醫學“水腫”“腎風”“腎勞”“溺毒”“癃閉”和“關格”等范疇，其基本病機為“本虛標實”[8]。“濁毒”既是一種對人體經絡氣血臟腑陰陽均造成損傷的致病因素，亦是蘊積于體內的病理產物。濁毒之邪重在“濁”，濁邪久蘊，凝聚成毒，“濁”邪遷延不愈，易生變端，“毒”邪阻滯脈絡，損害氣血，兩者常相兼致病，濁毒內蘊，損傷機體。病情遷延不愈，傷及脾腎。腎為先天之本，脾為后天之本，腎如薪火主水，脾如鼎釜主土，“水為萬物之源，土為萬物之母，二臟安和，一身皆治，百疾不生”(《醫宗必讀·虛勞》)。脾喜燥惡濕，而濁為陰邪，其性重濁黏膩，易阻滯氣機流動，治當健脾化濁；濁毒之邪內蘊日久，陽氣被遏，腎陽衰微，毒邪損害機體，治當補腎解毒[4]。故CRF以脾腎兩虛為本，濁毒內蘊為標。

化濁解毒方補腎健脾化濁，既固本以清源，又解毒以澄流。方中黃芪、白術補腎健脾、利水消腫，黃芪大補肺氣以益腎水之上源，兼以達表固衛，白術健脾益氣，使脾燥濕相濟，兩者共用，固本清源。積雪草、土茯苓、萆薢、水牛角四味共用，清熱利濕、化濁解毒，腎衰日久，腎絡瘀阻，以莪術、石見穿活血化瘀，又以水蛭破血通經、祛瘀生新；酒大黃通腑泄濁，給濁毒以出路，同時活血逐瘀、推陳致新。諸藥合用，以達到緩解臨床癥狀，保護殘存腎功能，延緩CRF進展的作用。

CRF的主要病理機制為腎臟的纖維化，包括腎間質纖維化和腎小球硬化。其中腎間質纖維化與慢性腎臟病的發展與預后密切相關[9]。腎間質纖維化可由多種細胞因子介導、多通道信號轉導而發生，其主要病理改變為腎臟中細胞外基質(extracellular matrix，ECM)大量沉積，是其合成增多及降解減少共同作用的結果[10]。

TGF-β1主要在病變的腎臟組織中表達，是最重要的促纖維化因子，可促進ECM的合成，刺激上皮細胞分化，抑制ECM降解和在受損部位自我誘生，從而產生瀑布效應[11-12]。α-SMA是肌成纖維細胞表達的代表性蛋白[13]，在正常腎臟組織中很少表達，然而在病理情況下，在腎小球系膜區、腎小球周圍間質、萎縮的腎小管周圍纖維化區與血管周邊明顯表達與增生，并參與腎臟纖維化的形成[14]。實驗[15]證明，腎小管間質損傷常常與α-SMA表達水平呈正相關，故α-SMA的過量表達可致腎臟纖維化不斷加重。HGF是一種負性調節纖維化的因子，其不僅作用于肝細胞，也存在于多種臟器中，可作為一種親腎因子在腎臟中表達，促進上皮細胞分裂，誘導上皮細胞遷移，影響細胞的增殖與分化，最終促進ECM降解[14,16-17]。此外，多項研究[18-20]發現，在腎間質纖維化進展的特定階段，TGF-β1與HGF存在著互逆平衡的關系。即在慢性腎臟病發展的早期，TGF-β1和HGF的表達水平均上升，但HGF的表達水平升高時又會減緩TGF-β1的上升趨勢；反之，當慢性腎臟病不斷進展加重時，這種平衡被打破，腎臟的自我保護作用亦逐漸降低，TGF-β1不斷升高，HGF的抑制作用減弱，并不斷被TGF-β1抑制，從而降低自身表達水平。

本研究結果提示，伴隨著CRF大鼠腎臟組織中TGF-β1的增高，HGF呈逐漸下降趨勢，同時大鼠腎功能下降、腎臟纖維化程度加重，說明伴隨著HGF的表達不斷被TGF-β1抑制，其抗纖維化作用亦逐漸減弱，證明可通過促進HGF表達、抑制TGF-β1表達從而延緩腎功能衰竭的進展。但在CRF發展早期，TGF-β1與HGF的表達水平是否存在共同上升階段，仍需進一步實驗證實。

總之，本實驗提示，TGF-β1的下降及HGF的升高可使α-SMA水平減少，說明化濁解毒方可能是通過抑制CRF大鼠腎臟組織中TGF-β1的表達并上調HGF的表達，從而起到抑制α-SMA表達的作用，達到改善CRF進展的目的。