蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導和轉錄活化因子3信號通路在局灶節段性腎小球硬化小鼠模型中的機制研究

顧鳳娟, 徐子斌, 許云鵬, 張燕子, 李麗香, 隋曉露,鄒杰鋒, 曾啟城, 謝婷妃, 陳繼紅

(1. 廣東省深圳市寶安區石巖人民醫院 腎內科, 廣東 深圳, 518000;2. 南方醫科大學附屬深圳寶安醫院 腎內科, 廣東 深圳, 518000)

局灶節段性腎小球硬化(FSGS)是導致終末期腎病(ESRD)的主要原因之一[1]。足細胞損傷是FSGS發生及發展的核心病理環節[2]。研究[3]發現，采用傳統的5/6腎切除術模型建立FSGS模型的穩定性較差，很難建立典型的FSGS病理類型。構建成模率高且具備更典型FSGS病理改變的動物模型將有利于探討足細胞損傷導致FSGS疾病進展的致病機制。蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導和轉錄活化因子3(JAK2/STAT3)信號通路介導多種細胞因子和生長因子的細胞內信號傳遞的共同途徑，活化相應靶基因，參與機體免疫反應、血管細胞遷移增殖和細胞凋亡等，并廣泛參與糖尿病腎病、狼瘡性腎炎等腎臟病的發生與發展，但在影響FSGS進展的機制研究中仍有待深入探討。本研究針對C57BL/6小鼠進行精準化的5/6腎切除術，建立典型FSGS病理改變小鼠模型，探討JAK2/STAT3信號通路影響FSGS進展的可能機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

選取6周齡雄性C57BL/6小鼠(購自北京維通利華動物實驗有限公司)60只，基礎飼料適應性飼養1周，隨機分為FSGS組(n=30)和對照組(n=30)。FSGS組小鼠在開腹后接受精準化5/6腎切除術，建立FSGS小鼠模型; 對照組為假手術組，僅暴露雙側腎臟，剝離腎周脂肪組織，而后復位縫合。本研究通過醫院動物倫理委員會審批(實驗編號: 2022-600)。

1.2 模型建立

1.2.1 FSGS組: 建立精準化5/6腎切除模型。通過直接減少腎單位建立FSGS模型，需排除腎盂所占體積，小鼠腎盂體積約占腎臟總體積的15.75%[4]。假設切除體積為y, 列方程(1-y-15.75%)/(1-15.75%)=1/3, 解出y=56%, 即切除左腎腎盂外2/3的腎組織，需分別切除離左腎上極及下極28%的腎臟總體積。腎臟總體積計算采用橢球公式[5], 即V=A×B×C×4/3π; 結合橢球缺體積公式[6], 即V=[π×A×B×(d+C)2][3-(d+C)/C]/3C;A、B、C分別為1/2寬、1/2厚、1/2長,d為1/2長減去單極切除的長度。假設d=xC, 即(1-28%)A×B×C×4/3π=[π×A×B×(xC+C)2][3-(xC+C)/C]/3C, 最終解出x=35%, 即分別在離左腎上極和下極35%最大長徑處進行切除，可切除左腎各約1/3的體積。

1.2.2 對照組: 對照組為假手術組，僅暴露雙側腎臟，剝離腎周脂肪組織后復位縫合。

1.2.3 術后重癥加強護理病房護理: 室溫25 ℃, 濕度55%, 術后連續3 d注射青霉素以預防感染。

1.2.4 建模成功標準: 小鼠24 h尿蛋白定量>100 mg, 蘇木精-伊紅(HE)染色顯示FSGS典型病理改變，判定造模成功。

1.3 觀察指標

術前和處死前1 d, 代謝籠收集并記錄小鼠24 h尿量。頸靜脈采血1 mL備用。術后10周處死小鼠，留取腎組織備用。

1.3.1 生化指標: 應用全自動生化分析儀檢測24 h尿蛋白、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。

1.3.2 腎組織病理學: 留取腎組織，采用10%福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋、切片，HE染色觀察腎組織病理學改變情況。

1.3.3 采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測腎組織JAK2mRNA、STAT3mRNA的表達: 取約100 mg腎臟皮質組織，充分研磨，使用Trizol提取總RNA, 使用反轉錄酶M-MLV(購自美國賽默飛世爾科技公司)將RNA反轉錄合成cDNA, 引物設計見表1。采用RT-qPCR儀(美國ABI), 并按下列條件進行擴增反應: 95 ℃預變性15 min, 95 ℃變性10 s, 60 ℃退火延伸30 s, 72 ℃延伸30 s, 共45個循環。采用2-△△CT方法，以GAPDH作為內參照，計算JAK2mRNA、STAT3mRNA的表達量。

表1 JAK2、STAT3的引物序列

1.3.4 采用Western Blot檢測腎組織磷酸化酪氨酸激酶2(p-JAK2)、JAK2、磷酸化信號轉導和轉錄活化因子3(p-STAT3)、STAT3的蛋白表達: 取腎臟皮質組織約100 mg, 加入蛋白質裂解液提取組織蛋白, 100 ℃水浴變性5 min, 上樣、電泳、轉膜，封閉2 h, 加入稀釋的一抗(p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、內參抗體濃度為1∶1 000, 美國CST)4 ℃孵育過夜，二抗(濃度1∶10 000, 美國CST)室溫孵育2 h。采用電泳凝膠成像儀進行顯色，采用Image J軟件，以目的蛋白灰度值與內參灰度值的比值計算p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的蛋白相對表達量。

1.3.5 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測白細胞介素-6(IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)水平: 取約100 mg的新鮮腎臟樣本，置于勻漿器內充分研磨, 4 ℃下以5 000轉/min離心5 min, 取上清，按ELISA試劑盒方法檢測各組IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 2組小鼠生化指標水平比較

與同組術前及對照組術后10周相比, FSGS組術后10周的24 h尿蛋白、Scr、BUN水平較高，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 FSGS組與對照組術前及術后10周的生化指標水平比較

2.2 2組小鼠腎組織的病理學變化比較

HE染色結果顯示，對照組小鼠腎小球結構清晰、完整，腎小管和腎間質結構正常，無明顯損傷。與對照組相比, FSGS組小鼠HE染色可見系膜區基質增生，大量腎小管上皮細胞發生凋亡、壞死、脫落或空泡樣變性，腎間質可見炎癥細胞浸潤，腎小囊腔擴張，腎小球代償性肥大及局灶性硬化，系膜細胞和系膜基質增生，節段加重，毛細血管袢受壓狹窄，局部消失。見圖1。

2.3 2組小鼠造模結果

造模過程中, FSGS組有1只小鼠死于麻醉，予以排除。FSGS組其余29只小鼠在造模過程中死亡3只，死亡率為10.3%; 對照組小鼠在造模過程中死亡1只，死亡率為3.3%。

2.4 2組小鼠腎組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA的表達水平比較

術后10周, FSGS組小鼠腎組織JAK2mRNA、STAT3mRNA表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

2.5 2組小鼠腎組織p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達水平比較

術后10周, FSGS組小鼠腎組織p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3、圖4。

2.6 2組小鼠腎組織IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平比較

術后10周, FSGS組小鼠腎組織IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

3 討 論

FSGS是常見的原發性腎小球疾病，病變呈進行性進展，最終可發展為ESRD。FSGS的發病機制復雜，與遺傳因素、足細胞損傷、血流動力學改變、循環因子、細胞凋亡等密切相關[7]。足細胞損傷是FSGS發生及發展的關鍵環節，當各種因素導致的足細胞損傷比率超過殘存足細胞代償能力時，最終會出現腎小球硬化，導致FSGS的發生。FSGS腎病模型有傳統5/6腎切除模型、阿霉素模型[8]、白喉毒素模型等。傳統5/6腎切除術模型是較為常用的腎病模型，缺點是對手術操作要求較高，手術切除的體積差異對模型穩定性影響較大[9]。本研究在傳統腎切除術基礎上，利用數學公式達成精準化切除，成功建立5/6腎切除術模型。該模型可精準測量腎臟長度及確定切除的位置，偏差較小，模型穩定性好，成功率高[10]。

JAK2/STAT3信號通路可被多種細胞因子和生長因子如干擾素-γ(IFN-γ)、IL-6、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等激活，參與免疫、炎癥反應及細胞增殖、分化和凋亡等[11]。白蛋白、糖基化終產物、高糖等可激活體外培養的近端腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞JAK/STAT信號通路，引起腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞分化和纖維連接蛋白合成增加，參與FSGS的發生與發展[12]。本研究結果顯示，與對照組相比, FSGS組腎組織JAK2/STAT3信號通路中JAK2mRNA、STAT3mRNA和p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達水平均升高，提示JAK2/STAT3信號通路的激活參與了FSGS的發生與發展。研究[13]顯示, JAK2抑制劑AG490可阻斷JAK/STAT信號通路，減輕小鼠阿霉素腎病蛋白尿、腎小球硬化、腎小管損傷、炎癥細胞浸潤并抑制腎臟纖維化，延緩FSGS的發展。足細胞中STAT3的過度激活與腎小球疾病有關，其下調可抑制成纖維細胞活化，減輕由腎毒性血清、艾滋病相關性腎病和糖尿病腎病引起的腎小球疾病，通過抑制JAK2/STAT3信號通路可延緩FSGS的發展[14]。

JAK2/STAT3信號通路與炎癥反應、纖維化反應密切相關。本研究結果顯示, FSGS組小鼠腎組織JAK2/STAT3信號通路下游炎癥因子及纖維化因子IL-6、MCP-1、α-SMA、TGF-β1水平升高，提示JAK2/STAT3信號通路活化并通過促進炎癥反應、腎組織纖維化參與了FSGS的發生及發展過程。分析其作用機制為: ① JAK2/STAT3信號通路激活, IL-6表達水平明顯升高, IL-6是JAK2/STAT3信號通路的誘導劑，與細胞膜IL-6受體結合能誘導JAK2/STAT3信號通路活化，以正反饋的形式促進炎癥反應的發生，誘導腎小球內皮細胞、足細胞損傷，導致腎間質纖維化形成[15-16]。② JAK/STAT信號通路可將IL-6、腫瘤壞死因子等多種炎癥因子信號傳遞至巨噬細胞，刺激細胞表面受體發生免疫應答，導致巨噬細胞浸潤。巨噬細胞活化后分泌多種炎癥因子，包括MCP-1等，誘導腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉化和凋亡[17], 加劇FSGS發展。③ STAT3抑制劑干預后可誘導α-SMA(+)的肌成纖維細胞凋亡，并抑制腎間質中α-SMA、纖維連接蛋白及Ⅰ型膠原的表達，減輕細胞外基質沉積[18]。TGF-β1可促使足細胞損傷、凋亡及腎小球硬化，導致腎臟纖維化。JAK2/STAT3信號通路活化可能通過增加α-SMA、TGF-β1的表達而導致腎小球細胞外基質沉積、腎小球基底膜增厚以及足細胞數量減少[19], 引起腎小球硬化和腎間質纖維化，參與FSGS的發生及發展[20]。

綜上所述，本研究通過精準化5/6腎切除術成功建立小鼠FSGS模型，而JAK2/STAT3信號通路活化可通過促進炎癥反應、腎組織纖維化等多種途徑參與FSGS的發生及發展過程。