lncRNA CYTOR/miR-193b-3p/HMGB1軸調控T細胞急性淋巴細胞白血病細胞MOLT-4增殖與凋亡的作用研究

楊春燕, 王海燕, 黃 倩, 程盼盼, 李 玲, 陳璐璐, 劉?；? 張 顥

(濟寧醫學院附屬醫院 血液科, 山東 濟寧, 272001)

T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)是急性淋巴細胞白血病(ALL)的一種亞型，約占ALL的15 %[1]。目前，隨著強化化療方案的廣泛應用, T-ALL患者預后結局均有所改善，但部分患者仍存在預后結局不佳的現象[2]。因此，亟需尋找治療T-ALL的新方法。lncRNA CYTOR屬于長鏈非編碼RNA(lncRNA)家族成員，參與調控多種腫瘤細胞的惡性表型。研究[3]顯示, lncRNA CYTOR在肝癌組織中表達增加，其通過競爭性吸附miR-125b-5p并上調KIAA1522的表達，促進肝癌細胞增殖和細胞周期進程，并阻礙肝癌細胞凋亡，促進肝癌的發展進程。lncRNA CYTOR在胰腺癌中表達升高，敲低lncRNA CYTOR可通過靶向miR-205-5p/CDK6軸阻礙體外胰腺癌細胞增殖和遷移，同時抑制體內腫瘤生長, lncRNA CYTOR可能是胰腺癌的潛在治療靶點[4]。然而目前尚未有研究闡明lncRNA CYTOR對T-ALL細胞增殖、凋亡的影響與機制。

根據Starbase靶基因預測結果表明, lncRNA CYTOR或許與miR-193b-3p有靶向結合關系，高遷移率族蛋白1(HMGB1)可能是miR-193b-3p的靶基因。miR-193b-3p可通過靶向MYB抑制T-ALL細胞的惡性表型，為T-ALL的治療提供了潛在靶點[5]。HMGB1是一種高度保守的蛋白質，其編碼基因位于染色體13q12。HMGB1在ALL中的表達顯著高于健康者，其可能通過誘導自噬、DNA損傷修復等方式促進ALL化療耐藥[6]。本研究主要觀察了lncRNA CYTOR/miR-193b-3p/HMGB1軸對T-ALL細胞增殖和凋亡的影響，以期為該類患者提供新的靶向治療依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人正常骨髓基質細胞系HS-5購于上海雅吉生物科技有限公司; T-ALL細胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1)購于中國科學院上海細胞庫; RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒購于大連寶生物; LipofectamineTM2000試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI購于北京索萊寶; 胎牛血清(FBS)購于浙江天杭生物科技股份有限公司; PCR引物、si-lncRNA CYTOR、si-HMGB1、si-NC、miR-193b-3p 模擬物和抑制劑、模擬對照序列和抑制劑陰性對照序列由上海生工公司合成; 兔抗人HMGB1、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關x蛋白(Bax)、活化的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase3)和β-actin抗體，購于中國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養: 將人正常骨髓基質細胞系HS-5和T-ALL細胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1)復蘇，均用含10% FBS的RPMI 1640培養液于普通培養箱中培養。當細胞生長密度為90%時，傳代培養。

1.2.2 逆轉錄-實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測lncRNA CYTOR、miR-193b-3p和HMGB1mRNA表達: 將對數期HS-5和T-ALL細胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1)均接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養24 h。提取總RNA逆轉錄為cDNA后，行PCR擴增。引物序列: lncRNA CYTOR上游5′-AGAATGAAGGCTGAGGTGTG-3′, 下游5′-CAGCGACCATCCAGTCATTTA-3′; miR-193b-3p上游5′-AAAGTCCCGCTGTCGTA TCC-3′, 下游5′-GTATCCAGTGCGTGTCGTGG-3′;HMGB1上游5′-TATGGCAAAAGCGG ACAAGG-3′, 下游5′-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3′;GAPDH上游5′-GGAGCGAGATC CCTCCAAAAT-3′, 下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;U6上游5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′, 下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-△△Ct法計算lncRNA CYTOR和HMGB1mRNA相對GAPDH及miR-193b-3p相對U6的表達量。

1.2.3 細胞轉染: 將處于對數生長期的MOLT-4細胞接種至6孔板中，以密度為1.0×105個/孔進行接種，孵育24 h后，采用LipofectamineTM2000脂質體法分別轉染si-NC(si-NC組)、si-CYTOR(si-CYTOR組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-193b-3p mimics(miR-193b-3p組)、si-HMGB1(si-HMGB1組)，共轉染si-CYTOR與anti-miR-NC(si-CYTOR+anti-miR-NC組)、共轉染si-CYTOR與anti-miR-193b-3p(si-CYTOR+anti-miR-193b-3p組)、共轉染si-CYTOR與pcDNA(si-CYTOR+pcDNA組)和共轉染si-CYTOR與pcDNA-HMGB1(si-CYTOR+pcDNA-HMGB1組)。12 h后更換培養液，繼續培養24 h后收集細胞，采用RT-qPCR法檢測細胞中lncRNA CYTOR或miR-193b-3p表達，采用蛋白質印跡(Western blot)法檢測細胞中HMGB1蛋白表達。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖: 將“1.2.3”中轉染后的細胞分別接種至96孔板中，以2.5×104個/孔的密度進行接種，在48 h后加入CCK-8 10 μL并繼續培養2 h, 用波長為450 nm的酶標儀(λ=450 nm)測定光密度(OD)值。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡: 將“1.2.3”中轉染后細胞分別接種至6孔板中，以1.0×105個/孔的密度進行接種，并于48 h進行收集。加500 μL結合緩沖液，重懸細胞。再依次加入Annexin V-FITC與PI各5 μL, 混勻后靜置10 min, 采用貝克曼FC500流式細胞儀及Cellauest軟件對細胞凋亡情況進行檢測。

1.2.6 Western blot檢測HMGB1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3蛋白表達: 于6孔板中接種2.5 mL“1.2.3”中各組細胞懸液(5.0×104個/mL), 培養24 h后，將RIPA裂解液(400 μL)加入到收集到的細胞中，并對細胞總蛋白進行提取。采用BCA實驗方法測定各組細胞膠原蛋白質的細胞濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE, 40 μg蛋白)后轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。于4 ℃冰箱中，分別用稀釋度均為1∶1 000的HMGB1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、β-actin一抗孵育過夜，洗膜后，再置于稀釋度為1∶2 000的山羊抗兔二抗中，室溫孵育1 h。1 h后向細胞內滴加ECL顯影，應用Image J軟件分析各分組細胞的總條帶膠原蛋白細胞灰度的統計數值及HMGB1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3相對β-actin的表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗: 根據Starbase軟件預測的結合位點，分別設計并合成lncRNA CYTOR、HMGB1的野生型熒光素酶載體(WT-CYTOR、WT-HMGB1)及突變型熒光素酶載體(MUT-CYTOR、MUT-HMGB1)。將MOLT-4細胞接種至6孔板中，以1.0×105個/孔的密度接種并培育24 h, 培育完畢采用LipofectamineTM2000脂質體法，轉染miR-193b-3p mimics與WT-CYTOR或WT-HMGB1、miR-NC與WT-CYTOR或WT-HMGB1、miR-193b-3p mimics與MUT-CYTOR或MUT-HMGB1、miR-NC與MUT-CYTOR或MUT-HMGB1。12 h后更換培養液。繼續培養24 h并裂解細胞。將裂解液放入離心機中，設置離心參數(3 500轉/min離心5 min, 半徑13.5 cm)后，檢測上清熒光素酶活性，結果以螢火蟲與海腎的熒光強度比值表示。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 T-ALL細胞系中lncRNA CYTOR、miR-193b-3p和HMGB1表達

與人正常骨髓基質細胞系HS-5比較, T-ALL細胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1)中lncRNA CYTOR表達升高, miR-193b-3p表達降低,HMGB1mRNA及HMGB1蛋白表達升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)。MOLT-4細胞各檢測指標與HS-5細胞差異最顯著，因此，選擇MOLT-4細胞進行后續實驗。見圖1、表1。

表1 T-ALL細胞系中lncRNA CYTOR、miR-193b-3p和HMGB1表達

2.2 下調lncRNA CYTOR對T-ALL細胞系MOLT-4增殖和凋亡的影響

si-NC組和si-CYTOR組MOLT-4細胞中lncRNA CYTOR表達量分別為(1.00±0.05)、(0.22±0.03), 差異有統計學意義(t=40.13,P<0.05), 說明CYTOR干擾載體構建成功。與si-NC組相比, si-CYTOR組Bcl-2蛋白表達降低, Bax、cleaved-caspase3蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與si-NC組相比, si-CYTOR組MOLT-4細胞增殖活性降低，凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 下調lncRNA CYTOR對MOLT-4細胞增殖和凋亡的影響

2.3 上調miR-193b-3p對T-ALL細胞系MOLT-4增殖和凋亡的影響

miR-NC組、miR-193b-3p組MOLT-4細胞中miR-193b-3p表達量分別為(1.00±0.02)、(2.63±0.14), 差異有統計學意義(t=34.58,P<0.05), 說明過表達miR-193b-3p成功。與miR-NC組相比, miR-193b-3p組Bcl-2蛋白表達降低, Bax、cleaved-caspase3蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與miR-NC組相比, miR-193b-3p組MOLT-4細胞增殖活性降低，凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 上調miR-193b-3p對MOLT-4細胞增殖和凋亡的影響

2.4 下調HMGB1對MOLT-4增殖和凋亡的影響

si-NC組、si-HMGB1組MOLT-4細胞中HMGB1蛋白表達量分別為(0.95±0.10)、(0.19±0.03), 差異有統計學意義(t=21.84,P<0.05), 說明HMGB1干擾載體構建成功。與si-NC組相比, si-HMGB1組的Bcl-2蛋白表達降低, Bax、cleaved-caspase3蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05); 與si-NC組相比, si-HMGB1組MOLT-4細胞增殖活性降低，凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、表4。

表4 下調HMGB1對MOLT-4細胞增殖和凋亡的影響

2.5 lncRNA CYTOR靶向結合miR-193b-3p調控HMGB1表達

miR-193b-3p與lncRNA CYTOR、HMGB1的結合位點見圖5A、5B。與共轉染miR-NC與WT-CYTOR或WT-HMGB1的MOLT-4細胞比較，共轉染miR-193b-3p mimics與WT-CYTOR或WT-HMGB1的MOLT-4細胞熒光素酶活性降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與共轉染miR-NC與MUT-CYTOR或MUT-HMGB1的MOLT-4細胞比較，共轉染miR-193b-3p mimics與MUT-CYTOR或MUT-HMGB1的MOLT-4細胞熒光素酶活性，差異無統計學意義(P>0.05), 見表5。此外, si-CYTOR組MOLT-4細胞中HMGB1蛋白表達量為(0.25±0.05), 低于si-NC組的(0.94±0.10), 差異有統計學意義(t=18.52,P<0.05);miR-193b-3p組MOLT-4細胞中HMGB1蛋白表達量為(0.21±0.03), 低于miR-NC組的(0.97±0.07), 差異有統計學意義(t=29.94,P<0.05), 見圖5C。

表5 雙熒光素酶活性檢測結果

2.6 下調miR-193b-3p逆轉lncRNA CYTOR敲低對MOLT-4細胞增殖和凋亡的影響

si-CYTOR組、si-CYTOR+anti-miR-NC組、si-CYTOR+anti-miR-193b-3p組MOLT-4細胞中miR-193b-3p表達量分別為(2.22±0.21)、(2.20±0.17)、(0.95±0.09), 組間差異有統計學意義(F=176.22,P<0.05), 說明MOLT-4細胞中miR-193b-3p表達下調。相較于si-CYTOR組和si-CYTOR+anti-miR-NC組, si-CYTOR+anti-miR-193b-3p組MOLT-4細胞增殖活性及HMGB1、Bcl-2蛋白表達升高，而凋亡率和Bax、cleaved-caspase3蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。si-CYTOR組與si-CYTOR+anti-miR-NC組各檢測指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖6、表6。

表6 下調miR-193b-3p逆轉lncRNA CYTOR敲低對MOLT-4細胞增殖和凋亡的影響

2.7 上調 HMGB1逆轉lncRNA CYTOR敲低對MOLT-4細胞增殖和凋亡的影響

與si-CYTOR組、si-CYTOR+pcDNA組比較, si-CYTOR+ pcDNA-HMGB1組中細胞增殖活性和HMGB1、Bcl-2蛋白水平升高，而細胞凋亡率、Bax、cleaved-caspase3蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7、表7。

表7 上調 HMGB1逆轉lncRNA CYTOR敲低對MOLT-4細胞增殖和凋亡的影響

3 討 論

T-ALL的發生發展受多種基因分子的調控，探究T-ALL中異常表達的基因及其相關機制，對發現新的治療靶點具有重要意義。lncRNA和miRNA是不同的非編碼RNA, lncRNA在miRNA分子海綿中進行調控，進而影響腫瘤細胞的增殖和凋亡[7]。研究[8]顯示, T-ALL發病過程由多種IncRNA共同參與。敲除lncRNA ARIEL可抑制體外T-ALL細胞增殖，并阻礙小鼠異種移植瘤生長; lncRNA ZFAS1可競爭性吸附miR-150, 進而上調ST6GAL1的表達促進T-ALL細胞對化療藥物阿霉素的耐藥性[9]; lncRNA NEAT1在T-ALL細胞中表達升高，敲低其表達可抑制T-ALL細胞增殖，其作用機制與靶向miR-146b-5p/NOTCH1軸有關[10]。T-ALL中異常表達的lncRNA為其治療提供潛在靶點。

lncRNA CYTOR作為lncRNA的一種類型，能夠對不同腫瘤的惡性表型及耐藥性進行調控。研究[11]顯示, lncRNA CYTOR可通過靶向miR-195促進非小細胞肺癌(NSCLC)細胞增殖和侵襲，并誘導NSCLC細胞的放射抗性，其有可能被用作NSCLC治療的分子靶點; lncRNA CYTOR在耐他莫昔芬的乳腺癌組織中呈高表達，其可增強乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥性[12]。本研究結果顯示, lncRNA CYTOR在T-ALL細胞系中的表達顯著高于人正常骨髓基質細胞系HS-5, 提示其可能也促進T-ALL的發展進程; 通過下調T-ALL細胞系中lncRNA CYTOR表達發現，下調lncRNA CYTOR可有效降低T-ALL細胞系增殖活性，并誘導其凋亡，這提示lncRNA CYTOR也有可能成為T-ALL治療的分子靶點。

本研究結果顯示, Bax/Bcl-2能夠調控細胞凋亡。正常生理狀態下, Bcl-2與Bax形成異源二聚體，抑制Bax的功能。當Bcl-2表達減少時, Bax被釋放，通過BH3結構域形成同源二聚體，增加線粒體膜的通透性，并將細胞色素C釋放于細胞質，產生誘導細胞凋亡的作用[13]。此外下調lncRNA CYTOR, T-ALL細胞系中Bcl-2蛋白表達減少, Bax蛋白表達增加，提示lncRNA CYTOR可能通過間接調控Bax/Bcl-2影響T-ALL細胞系凋亡。

本研究證實了lncRNA CYTOR可競爭性吸附miR-193b-3p, 且下調lncRNA CYTOR可促進T-ALL細胞系中miR-193b-3p的表達。miR-193b-3p作為miRNA的一員，對多種腫瘤的發展過程具有重要作用。研究[14-17]顯示, miR-193b-3p在舌鱗狀細胞癌、胃癌等腫瘤中呈低表達，上調miR-193b-3p可抑制腫瘤細胞的惡性表型。本研究顯示, miR-193b-3p在T-ALL細胞中表達顯著較低，上調miR-193b-3p可有效阻礙T-ALL細胞增殖，并誘導其凋亡，這提示miR-193b-3p對T-ALL的發展起抑制作用; 此外，下調miR-193b-3p可逆轉下調lncRNA CYTOR對T-ALL細胞系增殖的抑制作用及凋亡促進作用，這提示lncRNA CYTOR可能通過競爭性吸附miR-193b-3p來調控T-ALL細胞系增殖和凋亡。

HMGB1屬于細胞核內的一種非組蛋白染色體結合蛋白，在哺乳動物組織及細胞中普遍存在，參與足細胞分化、遷移及腫瘤耐藥等多種生理或病理過程。研究[18]顯示，過表達miR-142-3p可通過靶向抑制HMGB1增強乳腺癌細胞對化療藥物阿霉素的敏感性, miR-142-3p/HMGB1軸可能為改善乳腺癌耐藥性提供了新靶點。miR-1179的過表達可通過靶向抑制HMGB1阻礙胃癌細胞增殖和侵襲[19]; lncRNA DSCAM-AS1可通過競爭性吸附miR-577, 上調HMGB1的表達促進NSCLC細胞增殖和侵襲，進而促進NSCLC的發展進程[20]。HMGB1在白血病中的作用也被廣泛關注。研究[21]顯示, HMGB1在ALL患者血清中呈高表達，且與患者分期及分型密切相關; 復發ALL患者血清中HMGB1水平顯著高于完全緩解患者，血清HMGB1水平可作為ALL預后評估的生物學標志物[22]。本研究結果顯示, T-ALL細胞系中HMGB1呈高表達，下調其表達可抑制T-ALL細胞系增殖，并促進細胞凋亡，說明HMGB1促進T-ALL的發展進程，提示其可作為T-ALL的治療靶點。同時，本研究結果顯示，下調lncRNA CYTOR或上調miR-193b-3p均可抑制T-ALL細胞系中HMGB1蛋白表達，而下調miR-193b-3p逆轉了下調lncRNA CYTOR對T-ALL細胞系中HMGB1蛋白表達的抑制作用，進一步說明lncRNA CYTOR可靶向miR-193b-3p正向調控HMGB1表達，提示其通過靶向miR-193b-3p/HMGB1軸來影響T-ALL細胞系增殖和凋亡。

綜上所述, lncRNA CYTOR在T-ALL細胞系中的表達明顯升高，下調其表達可有效阻礙T-ALL細胞系增殖，并誘導細胞凋亡，其可能通過靶向miR-193b-3p/HMGB1軸發揮作用，或可成為治療T-ALL的分子靶點。