小麥BNS雄性不育基因連鎖群分析和主效QTLs初步定位

楊 靖，衛 笑，付慶云，曹銀萍，茹振鋼，李友勇

(河南科技學院/現代生物育種河南省協同創新中心，河南新鄉 453003)

1 材料與方法

1.1 試驗材料與播種

BNS不育系由茹振鋼教授提供[1,9]；鄭麥366是河南省農業科學院培育的一個優質強筋小麥品種，由中國農業科學院矮敗小麥研究中心新鄉基地惠贈。自2008年以來，BNS不育系一直在河南科技學院輝縣小麥育種基地種植，歷年從10月1日到11月18日分期播種，每8 d 1個播期，共設7個播期，用來觀察BNS的育性等。作圖群體構建的材料，包括父本鄭麥366和母本BNS及其F1和F2，均在同年10月9日播種，此期是BNS的不育播種期[1-5]，也是當地小麥的適播期。F1自交產生F2群體種子時，為了保證不育基因的有效傳遞，人工雜交的F1在當年11月18日可育播期播種，植株抽穗后套袋，成熟后收獲套袋穗，選擇典型株穗混合脫粒，即F2種子，F2種子在不育播期播種，產生F2群體。材料田間種植方式：行長3.5 m，行寬0.3 m，BNS、鄭麥366、F1種植株距12 cm，F2株距15 cm。

1.2 材料取樣和表型調查

播種出苗后各世代單株依次標記，待生長至4個以上分蘗時，取親本和F1各10個單株的第3、4分蘗葉片，剪1 cm段，混合后取樣2 g；F2全部單株分別取樣，剪1 cm段，混合后取樣2 g。所有樣品液氮冷凍1 min，之后置于-72 ℃保存，備用。

取20株親本和F1標記株，F2取所有標記單株，主莖和第1、2分蘗抽穗后全部套袋，第1分蘗套袋穗用于調查花粉可育率，成熟后收取主莖和第2分蘗套袋穗，計數小穗數和結實粒數；自交結實率計算采用國內法，即自交結實率=第1、2小花結實粒數/(2×總小穗數)×100%。調查的麥穗首用主莖穗，備用第2分蘗穗。在標記植株第1分蘗始花當天，取主莖穗上、中、下3個部位的小穗各1個，用卡諾液固定，然后取固定的每個小穗第1小花的3枚花藥，擠出花粉粒，用I2-KI染色，參照水稻和小麥的計數方法[1,3,10]對完全染為黑色且圓形的可育花粉粒數和花粉粒總數進行統計，每個片子取3個視野，共9個觀察值，計算平均數，花粉可育率=可育花粉粒數/花粉粒總數×100%。

1.3 DNA的提取及不育、可育池的建立

參考Xing等[7]和孫慧慧等[8]的CTAB法提取幼葉基因組總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度。

按照BSA建立方法[11]，根據自交結實率和花粉可育率2個表型調查結果，取F2群體中表型值最低單株和最高單株各10株，各自的DNA等量混合，形成自交結實率可育池(A1)和不育池(B1)、花粉可育率可育池(A2)和不育池(B2)。

1.4 SSR引物的選擇及檢測

在R?der等[12]和Somers等[13]構建的SSR圖譜上，從染色體的短臂端開始，每1～3 cM 選一個分子標記，首先選擇單擴增產物位點標記，沒有單擴增產物位點標記時選擇二產物位點標記。從小麥GrainGenes網站(http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes/browse.cgi?class =marker/)上獲得引物序列，由上海生工生物技術有限公司合成。

參考Xing等[7]和孫慧慧等[8]的方法，使用Biometra Standard Gradient梯度PCR儀進行PCR檢測。PCR反應體系為25 μL，包括超純水18.2 μL，10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP Mix(2.5 mmol·L-1each)2 μL，Taq DNA Polymerase(5 U·μL-1)0.3 μL，模板DNA(50 ng· μL-1)1 μL，上下游引物(10 μmoL·L-1)各0.5 μL。引物Xgwm、Xwmc、Xbarc的反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，45個循環；72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。引物Xcfd的反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s； 72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min， 12 ℃保存。擴增產物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，恒壓100 V，電泳50 min。電泳結束后，用UVItec-FireReader凝膠成像分析儀觀察并 保存。

1.5 遺傳圖譜的構建及QTL的定位

用BSA池篩選得到的多態性標記引物對F2群體各單株進行PCR擴增，PCR方法同1.4。用Mapmaker/Exp 3.0b[14]軟件計算連鎖標記的遺傳距離，用WinQTLCart 2.5軟件[15]處理各植株的連鎖標記基因型和表型數據，檢測QTL位點。

由于SSR標記在所屬連鎖群常有多位點和易位現象，為了準確定位SSR標記在BNS的連鎖群，將連鎖標記在BNS中重擴增，擴增產物由北京優博蘭基因技術有限公司完成測序，將測序序列在小麥中國春參考基因組Chinese Spring RefSeq V2.1[16]中進行比對，定位連鎖標記的物理位置，并定位QTLs的相對位置。用Mapdraw軟件[17]繪制連鎖標記和QTL的連鎖圖。

2 結果與分析

2.1 F2群體結實率調查結果

從表1可以看出，不育播期(10-09)播種的BNS和F1的自交結實率分別為0.95%和0，均表現為高不育，在可育播期(11-18)播種的BNS和F1的自交結實率分別為49.49%和41.23%；而在不育播期和可育播期播種的鄭麥366均可育，11月份播種的結實率有所下降，原因可能是后期發育快，不育小花較多。F2作圖群體共143株，從表2可以看出，F2套袋自交結實率和花粉可育率平均值分別為16.33%和23.58%，偏態分布，均偏向不育性，說明該現象是不育顯性所致，但BSA池極端表型與親本一致，結實率最低為0，最高同可育親本鄭麥366。

表1 親本及F1在不育和可育播期播種的自交結實率Table 1 Self-seed setting rate of parents and F1 generation plotted in sterile and fertile sowing date %

2.2 不育基因連鎖SSR標記篩選結果

在小麥分子標記圖譜上選用710對SSR標記引物，分別對BNS、鄭麥366、F1、A1池、B1池、A2池和B2池進行DNA擴增，挑選出在親本間和兩對BSA池間均存在差異且差異表現一致的標記(不育基因的連鎖標記)，最終篩選出530對有效擴增標記引物，其中在BNS和鄭麥366親本間存在110對多態性引物，與BNS不育基因連鎖的標記引物有12對，分布在8條染色體上(表3)。部分標記的擴增電泳圖見圖1，可以看出，這些標記對鄭麥366、BNS和F1的擴增圖譜帶型清晰，但個別標記(如Xgwm124和Xwmc795的A池)對兩個不育池和可育池的擴增圖譜帶型與F1一致，主要原因是主效不育基因有2對，且具有顯性特征，不育池中可能存在個別植株其中一個不育基因位點為純合隱性可育，部分標記檢測顯示的父本帶可能是這些位點的擴增產物，但不影響母本位點的引物篩選。

表2 F2群體2個表型BSA池的自交結實率和花粉可育率Table 2 Self-seed setting rate and fertile pollen rate in the two phenotypic BSA pools %

表3 親本和BSA池篩選的共分離連鎖SSR分子標記Table 3 Co-segregating SSR linkage markers screened from the DNA of parents and BSA pools

2.3 QTL定位分析結果

用12個多態SSR標記對F2群體143個單株進行DNA擴增，部分標記的擴增圖譜見圖2。讀取各連鎖標記擴增多態性，在Mapmaker/Exp 3.0b軟件中計算連鎖標記圖距，發現共有3個多標記群和4個單標記群，第1個多標記群有4個標記，分別為Xbarc267(7B)、Xwmc517(7B)、Xwmc658(2A)和Xwmc617(4A/4B)；第2個多標記群有2個標記，分別為Xwmc795(5A)和Xwmc752(5A)；第3個多標記群有2個標記，分別為Xwmc396(7B)和Xbarc55(1B/2B)。其余4個標記Xcfd5(5B)、Xgwm124(1B)、Xwmc506(7D)和Xwmc332(2B)為單標記。從連鎖標記 所屬染色體看，2B、5A和7B染色體上的標記 較多。

M：DNA Marker；P1：鄭麥366；P2：BNS；F1：BNS×鄭麥366雜交F1；A1：自交結實率可育池；B1：自交結實率不育池；A2：花粉可育率可育池；B2：花粉可育率不育池。圖2同。

用WinQTLCart 2.5軟件處理連鎖標記圖距數據，首先，用單標記分析法檢測與不育QTL顯著連鎖的標記，結果共發現5個標記與不育QTL顯著連鎖，分別為Xbarc55(1B/2B)、Xwmc332(2B)、Xwmc517(7B)、Xwmc396(7B)和Xwmc752(5A)。然后采用區間分析法檢測QTL位點，結果檢測到2個主效不育QTL，分別與單標記Xwmc332和第3個多標記群連鎖。

由于連鎖標記Xbarc55中有二產物位點標記，因此連鎖標記的所屬染色體尚不能確定，為了準確定位連鎖標記的連鎖群，將各標記擴增產物序列在中國春基因組中進行比對，結果顯示，Xbarc55位于2B染色體上，其他標記的所屬染色體與標記來源圖譜一致。Xbarc55和Xwmc396在Mapmaker/Exp 3.0b檢測中是連鎖的，可能是二者均連鎖不育QTL所致。將Xbarc55(2B)與單標記Xwmc332(2B)連鎖，按SSR圖譜距離進行QTL檢測，結果檢測到1個QTL，與自交結實率和花粉可育率均相關，位置靠近標記Xwmc332，且貢獻率較高，達13.20%，因此是一個主效不育QTL，命名為qBS1；同樣方法，將Xwmc396(7B)與Xwmc517(7B)連鎖，重新進行QTL檢測，結果也檢測到1個QTL，位于兩個標記之間，距Xwmc396較近，與自交結實率和花粉可育率也均相關，貢獻率高達19.66%，表明也是主效不育QTL，命名為qBS2。

A～D分別為標記Xcfd5、Xwmc506、Xgwm124、Xwmc617的PCR結果。1～18：F2單株。

2.4 2個主效QTL的遺傳參數

從表4可看出，qBS1和qBS2的表型變異解釋率分別為13.20%和19.66%，表明qBS2的遺傳效應大于qBS1。2個主效QTL的顯性效應與加性效應的絕對值比值均大于1，表明這2個QTL的顯性效應大于加性效應，且均具有顯性效應。2個主效QTL的加性效應均為正值，說明其加性效應來源于母本BNS。2個主效QTL及其連鎖標記的連鎖圖見圖3。

表4 檢測到與BNS不育相關的主效QTLTable 4 Major QTLs detected for BNS sterility

圖3 BNS兩個主效不育QTL及其SSR連鎖標記的連鎖圖

3 討 論

BNS是一個新型小麥溫敏雄性不育系，低溫不育高溫可育。前期研究初步發現，該不育系的不育性和育性恢復是非等位基因遺傳方式，分別含有兩對主效基因[4]，兩個育性恢復基因已初步定位在1B和2B染色體上[7]，而本研究的目的是檢測不育基因的QTL并初步定位其所在的染色體。利用BNS和它的完全保持系鄭麥366的F2為作圖群體，建立自交結實率和花粉可育率2對BSA表型池，用SSR分子標記篩選連鎖標記并檢測QTL，結果檢測到2個主效QTL(qBS1和qBS2)，分別定位在2B和7B染色體上。

3.1 作圖群體

對雄性不育與非雄性不育性狀QTL定位群體的建立有很大區別。在雄性不育后代的分離群體中，由于不育個體不能傳遞后代，因此構建重組自交系和近等基因系異常困難，在這種背景下，F2是最佳作圖群體。又由于不育系不結實，因此，產生F2群體的F1需在可育播期內播種，保證不育等位基因以同等概率傳遞，這是建立平衡基因頻率F2群體的重要保證。本研究中F1是在11月18日播種的，是育性最高恢復播種期，建立的F2群體國內法平均結實率為16.33%，最高結實率為 69.68%，說明F2育性呈偏態分布，偏不育性，這種偏態是不育顯性的結果，但它不影響連鎖標記的篩選，因為高結實率的單株可以滿足BSA池的建立。F2作圖群體中最高結實率為69.68%，屬高結實率水平，普通可育小麥品種的國內法自交結實率最高也在90%左右。

3.2 2B、5A和7B染色體與不育QTL連鎖群

本研究連鎖標記篩選結果顯示，2B、5A和7B染色體上的連鎖標記較多，占總連鎖標記數的70%。在5A染色體上檢測到1個QTL，但貢獻率較小，且僅與自交結實率相關，因此認為是微效QTL。影響自交結實率的因素很多，除花粉育性外，穎殼張開特性、自交親和性等均影響結實率，BNS的不育性是由于花粉敗育，因此主效不育QTL必須與花粉育性相關。本研究在5A染色體上檢測到2個連鎖標記，其連鎖的QTL雖不是主效的，但遺傳性穩定，對不育性有較大影響，該不育位點及作用尚需繼續觀察；2B染色體是小麥光溫敏雄性不育基因和恢復基因的集中載體，如小麥光溫敏雄性不育系BS20[18]、兩極型光溫敏不育系337S[19]的一個不育基因均定位在2B染色體上，光溫敏D2型小麥雄性不育的質核互作型不育基因也與2B染色體相關[20]。本研究篩選到的連鎖標記Xwmc332也位于2B染色體上，擴增產物比對發現，引物序列高度保守，因此認為是一個緊密連鎖的分子標記，其連鎖的QTL為主效QTL；7B染色體是主效不育基因連鎖群，本研究中有2個連鎖標記位于該染色體上，而且前期恢復基因定位結果也表明該染色體上含有不育基因[7]。

3.3 QTL與連鎖標記的距離

從連鎖標記以及QTL初步定位的結果來看，標記與標記之間、標記與QTL之間的距離均比較大，但用單標記來檢測QTL，標記與QTL是緊密連鎖的，相關性達顯著或極顯著水平。測定距離較大的原因，主要來自三個方面，一是不同時期、不同遺傳背景下測定的連鎖圖距可能不同，如Xbarc55和Xwmc332在Somers等[13]的SSR圖譜位置和小麥GrainGenes網站的圖譜位置也不完全相同；二是交換熱點的存在，品種間染色體結構具有多態性，連鎖圖譜和參考基因組分子圖譜常常存在差異，甚至也有交錯差異[21]，如中國春和BNS雖然都是普通小麥，但在品種演化上兩個材料經歷不同；三是試驗結果計算的交換值偏高，高交換值來自高重組個體數，如F2作圖群體中標記的分離是一對位點，但表型的分離則是2對主基因及微效基因共同作用的結果，此外雄性不育的發生過程中，主效基因起決定作用，下游相關基因級聯放大，任一因子異常，均可導致花粉敗育[22]。研究發現，在BNS中有多個不育相關基因(如wtms1[8]、TaAPT2[23]、ATP1[9,24-25]、TA1和TA2[26]、IAA代謝途徑相關基因[27]、小熱激蛋白基因hsp23.5[28]等)，這些多基因重疊，也可使重組型個體數量增加，導致計算的交換值偏大，然而從BSA池篩選到的QTL單標記分析結果，可以看出標記與QTL之間的實際距離要小得多。

3.4 2個QTL的遺傳效應

前期BNS不育性遺傳學檢測顯示，2個不育基因的作用不等效，但作用累加[4]，本研究定位到的2個QTL的遺傳效應也是不等效的，7B染色體上的qBS2比2B染色體上的qBS1遺傳效應高。2個不育基因的非等效性，在BNS早期系BNY-S中也有反映，其不育率約為80%[8,23]，這可能是高效應位點的作用結果，BNS的完全不育性重組了新的不育基因[8]，推測新引入的不育基因為qBS2。本課題組前期在BNS與典型保持系、典型恢復系雜交組合中的測定結果顯示，高效應位點的效應量是低效應位點的2～3倍[4,7]。BNS與其他小麥品種雜交，F1組合有完全不育、高不育、低不育和完全可育4種類型，這分別對應2對不育基因、高效應不育基因、低效應不育基因和不含不育基因的基因型。

4 結 論

用BNS和鄭麥366的F2為作圖群體，建立自交結實率和花粉可育率兩個表型BSA池，選用分布在小麥21條染色體上的710個SSR分子標記，在BSA池中篩選出12個連鎖標記，共檢測到2個主效不育QTL，分別為qBS1和qBS2，其中qBS1位于2B染色體上，緊密連鎖Xwmc332和Xbarc55 分子標記；qBS2位于7B染色體上，緊密連鎖Xwmc396和Xwmc517 分子標記，qBS2的遺傳效應大于qBS1。這些結果為進一步精細定位不育基因提供連鎖標記線索。