小麥莖基腐病病原假禾谷鐮刀菌與赤霉病之間的關(guān)系

江 航，祁 凱，馬立國，張 博，張悅麗，馬國蘋，齊軍山

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/山東省植物病毒學(xué)重點實驗室，山東濟南 250100)

小麥莖基腐病(Fusarium crown rot，F(xiàn)CR)廣泛發(fā)生于干旱與半干旱小麥種植區(qū)。該病害最早發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)50年代的澳大利亞，之后相繼在美國、新西蘭、加拿大、阿根廷等國家被發(fā)現(xiàn)并報道[1-4]。小麥莖基腐病是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、假禾谷鐮刀菌(Fusariumpseudograminearum)、黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)等多種鐮刀菌復(fù)合侵染引起的一種土傳病害，在小麥整個生育期均可發(fā)生[5]。發(fā)病時，發(fā)病小麥莖基部逐漸變褐，濕度大時，在發(fā)病部位可見粉紅色霉層，嚴(yán)重時可引起小麥死亡，形成白穗[6]。小麥莖基腐病不僅嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量，其病原菌產(chǎn)生的真菌毒素還能夠影響小麥品質(zhì)[7]。由于秸稈還田導(dǎo)致病原菌在土壤中積累，加之主栽品種普遍感病[8-9]，小麥莖基腐病在黃淮地區(qū)快速蔓延，已經(jīng)成為小麥生產(chǎn)中潛在的重要病害，嚴(yán)重威脅中國的糧食安全。

2012年，中國首次報道由假禾谷鐮刀菌引起的小麥莖基腐病[10]。此后，在山東、河南、河北、陜西、甘肅、寧夏、新疆等大部分地區(qū)，發(fā)現(xiàn)假禾谷鐮刀菌是這些地區(qū)小麥莖基腐病的優(yōu)勢病原菌[11-14]。假禾谷鐮刀菌不僅導(dǎo)致小麥莖基腐病，還能夠引起小麥赤霉病，但相關(guān)報道較少。2013年，在河北省發(fā)現(xiàn)假禾谷鐮刀菌可引起小麥赤霉病[15-16]。小麥赤霉病不僅造成小麥減產(chǎn)，其病原菌還能夠合成危害人畜健康的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)等毒素[7]。然而由假禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病在黃淮麥區(qū)的研究較少，需要進一步的研究來明確兩者之間的關(guān)系。

小麥莖基腐病和赤霉病都是小麥生產(chǎn)上的重要病害。其中小麥莖基腐病已成為黃淮地區(qū)小麥生產(chǎn)上最主要的病害，其優(yōu)勢病原假禾谷鐮刀菌與小麥赤霉病的關(guān)系目前仍不清楚。本研究于2021年春從山東省小麥莖基腐病發(fā)生嚴(yán)重的田塊采集病株，對病株上分離到的菌株進行鑒定，并測定這些菌株在小麥莖基部和小麥穗部的致病力；于小麥成熟期，在相同田塊采集小麥赤霉病病株，對病穗進行組織分離并鑒定，以期明確假禾谷鐮刀菌與小麥赤霉病之間的關(guān)系，為預(yù)防假禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小麥發(fā)病樣品采集

本試驗所有小麥病株和病穗分別于2021年3月和6月采自山東省濟南市商河縣許商街道五里廟村，小麥品種為濟麥22。

1.2 發(fā)病組織真菌的分離純化

采用組織分離法對小麥苗期根部、莖基部和葉鞘以及小麥成株期穗部的真菌進行分離培養(yǎng)。具體操作：將發(fā)病部位用自來水清洗干凈，在無菌環(huán)境中分別將根部、莖基部、葉鞘以及病穗組織放入70%的乙醇中消毒30 s，隨后轉(zhuǎn)入3%的NaClO溶液中消毒90 s，再用無菌水洗滌3遍。將消毒后的根部、莖基部、葉鞘以及小麥穗部分別轉(zhuǎn)接至提前倒好的PDA培養(yǎng)基中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。將長出的真菌純化培養(yǎng)并進行單孢分離，菌株純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分離菌株鑒定

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩種方法對菌株進行鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定：將分離到的所有菌株分別轉(zhuǎn)接至PDA平板中，待菌落長大后，根據(jù)菌落的形態(tài)對所有菌株進行形態(tài)學(xué)鑒定。分子生物學(xué)鑒定：用牙簽分別刮取不同菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌絲，利用CTAB法分別提取不同菌株的基因組DNA，用引物ITS1/4[17]分別擴增所有菌株的ITS序列，PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行Blast比對分析。另外以提取的不同菌株的基因組DNA為模板，分別用禾谷鐮刀菌特異性引物Fg16NF/R[18]、假禾谷鐮刀菌特異性引物Fp1-1/2[19]和麥根腐平臍孺孢特異性引物COSE-F/R[20](表1)進行PCR擴增，根據(jù)擴增條帶的有無和大小進行菌株鑒定。本研究中所有的PCR產(chǎn)物均用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表1 本研究中使用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 病原菌對小麥莖基部致病力測定

取適量小麥種子(品種為濟麥22)，用3%的NaClO溶液進行表面消毒，用無菌水沖洗3遍，然后置于鋪有3層無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中催芽3 d，催芽期間，每隔12 h用無菌水沖洗小麥種子。將待測菌株在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)3 d，然后用5 mm打孔器在菌落邊緣打菌餅。借鑒套菌碟的方法測定不同菌株對小麥莖基部的致病力[21]，并對方法進行部分改進。具體方法：將菌餅貼在胚芽基部，然后用無菌紗布將菌餅與催芽3 d的胚芽卷起來，使菌餅緊貼胚芽，每塊紗布卷10株小麥胚芽，每個菌株重復(fù)3次，將處理后的胚芽置于鋪有3層濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，以未接菌的PDA培養(yǎng)基作為對照。然后置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(12 h黑暗，12 h光照)，培養(yǎng)期間，每天給培養(yǎng)皿中補充無菌水，7 d后調(diào)查發(fā)病情況并拍照。

1.5 病原菌對小麥穗部致病力測定

用牙簽挖取在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d的待測菌株的菌塊，移至CMC(羧甲基纖維素鈉)培養(yǎng)基中，置于25 ℃，175 rpm的搖床中培養(yǎng) 5 d，將分生孢子的濃度調(diào)為1×105個·mL-1(對于不產(chǎn)孢的菌株，用菌絲接種)。選取揚花期的小麥穗(品種為濟麥22)，然后將10 μL的孢子懸浮液接種于小麥穗中部偏下的小穗中，分別在小麥穗部和保鮮袋中噴水，將保鮮袋套在小麥穗上保濕2 d，每個菌株接種8個小麥穗，14 d后統(tǒng)計發(fā)病情況并拍照。

2 結(jié)果

2.1 小麥莖基部病菌的分離

2021年3月，山東省濟南市商河縣五里廟村小麥苗長勢整體較弱，部分小麥還出現(xiàn)了死苗的現(xiàn)象，經(jīng)初步判斷為該地區(qū)暴發(fā)了小麥莖基腐病，隨后在該發(fā)病嚴(yán)重的田塊采集小麥病株，并對發(fā)病小麥根部、莖基部和葉鞘處進行組織分離和病原菌鑒定，結(jié)果共分離到21種真菌(表2)。

表2 小麥病株莖基部分離的菌株Table 2 Strains isolated from diseased wheat stem base

2.2 分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

將分離到的菌株在PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，可以看到，菌株CAJA211(C01)、CAJA215(C05)和CAJA218(C08)在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌絲稠密，顏色呈白色或黃色，在培養(yǎng)基中易產(chǎn)生紅色的色素(圖1)；菌株CAJA212(C02)、CAJA213(C03)、CAJA214(C04)、CAJA216(C06)、CAJA217(C07)、CAJA21A(C10)、CAJA21B(C11)、CAJA21C(C12)、CAJA21D(C13)、CAJA21G(C16)、CAJA21H(C17)、CAJA21J(C18)、CAJA21L(C20)和CAJA21M(C21)在PDA培養(yǎng)基上也生長迅速，氣生菌絲稠密，呈絨毛狀，充滿整個培養(yǎng)皿，顏色呈白色，在培養(yǎng)基中形成粉紅色或紅色的色素(圖1)；菌株CAJA219(C09)、CAJA21F(C15)和CAJA21K(C19)的氣生菌絲較少，菌落顏色呈深灰色，菌落邊緣具有輪紋(圖1)；菌株CAJA21E(C14)的氣生菌絲稀疏，顏色呈白色，在培養(yǎng)基中形成黃色的色素。根據(jù)菌株的形態(tài)特征，初步將菌株C01、C05和C08鑒定為禾谷鐮刀菌(F.graminearum)，菌株C02、C03、C04、C06、C07、C10、C11、C12、C13、C16、C17、C18、C20和C21鑒定為假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum)，菌株C09、C15和C19鑒定為麥根腐平臍蠕孢(Bipolarissorokiniana)。

2.3 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對所有菌株的ITS序列分別進行Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株C01、C05和C08的ITS序列與禾谷鐮刀菌的ITS序列相似度最高；菌株C02、C03、C04、C06、C07、C10、C11、C12、C13、C16、C17、C18、C20和C21的ITS序列與假禾谷鐮刀菌的ITS序列相似度最高；菌株C09、C15和C19的ITS序列與麥根腐平臍蠕孢的ITS序列相似度最高；菌株C14的ITS序列與多生枝鼻菌(Cladorrhinumfoecundissimum)的ITS序列相似度最高(圖2A)。禾谷鐮刀菌特異性引物、假禾谷鐮刀菌特異性引物和麥根腐平臍孺孢特異性引物的PCR擴增結(jié)果表明，菌株C01、C05和C08為禾谷鐮刀菌(圖2B)，菌株C02、C03、C04、C06、C07、C10、C11、C12、C13、C16、C17、C18、C20和C21為假禾谷鐮刀菌(圖2C)，菌株C09、C15和C19為麥根腐平臍蠕孢(圖2D)。其中，假禾谷鐮刀菌占比66.67%，禾谷鐮刀菌和麥根腐平臍蠕孢均占 14.29%。

A：ITS引物的PCR結(jié)果；B：禾谷鐮刀菌特異性引物的PCR結(jié)果；C：假禾谷鐮刀菌特異性引物的PCR結(jié)果；D：麥根腐平臍蠕孢特異性引物的PCR結(jié)果。M代表DL2000，1～21分別代表菌株C01～C21(對應(yīng)的菌株見表2)，CK代表陽性對照(H2O)。

2.4 分離菌株對小麥莖基部的致病性

選取禾谷鐮刀菌菌株C01、C05和C08以及部分假禾谷鐮刀菌菌株C03、C04、C06、C10、C11、C13、C16、C17、C20和C21共13種菌株，測定其在小麥苗期對小麥莖基部的致病力。結(jié)果表明，選取的所有菌株都能引起嚴(yán)重的小麥莖基腐病癥狀，在莖基部出現(xiàn)了變褐、腐爛的現(xiàn)象，而對照小麥莖基部無此現(xiàn)象出現(xiàn)(圖3)。

CK：未接菌。 CK：Uninoculated.

2.5 分離菌株對小麥穗部的致病性

利用2.4的13個菌株，測定其對小麥穗部的致病力，結(jié)果表明，所有菌株均能引起典型的小麥赤霉病癥狀(圖4A)。對小麥穗部接種點進行組織分離和病原菌鑒定，利用禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌特異性引物對重新分離到的真菌分別進行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)在小麥穗部分離到了與接種時相對應(yīng)的菌株(即接種假禾谷鐮刀菌的麥穗分離到的是假禾谷鐮刀菌，接種禾谷鐮刀菌的麥穗分離到的是禾谷鐮刀菌)(圖4B)。

A：小麥穗部接種禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌后的癥狀，CK代表接種無菌水；B：禾谷鐮刀菌特異性引物(左)和假禾谷鐮刀菌特異性引物(右)對發(fā)病穗部分離到的菌株的PCR檢測結(jié)果，M代表DL2000，1～13分別代表菌株C01、C03、C04、C05、C06、C08、C10、C11、C13、C16、C17、C20和C21(對應(yīng)的菌株見表2)，CK代表陰性對照(H2O)。

表3 玉米秸稈和小麥病株穗部分離的菌株Table 3 Strains isolated from corn straw and diseased wheat heads

2.6 玉米秸稈上子囊殼的鑒定

2021年3月，在小麥莖基腐病重病田塊，發(fā)現(xiàn)部分還田的玉米秸稈上存在一些真菌的子囊殼(圖5A)，挑取這些子囊殼并將其壓開鏡檢，發(fā)現(xiàn)其中的子囊孢子尚未成熟(圖5B)，無法直接鑒定。將壓開子囊殼的水溶液涂布于PDA培養(yǎng)基上，次日挑選單菌落進行培養(yǎng)并鑒定，發(fā)現(xiàn)從子囊殼水溶液中分離出的菌株P(guān)MAJ211(P01)和PMAJ212(P02)分別與禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌的形態(tài)相似(圖5C)；用禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌特異性引物進行進一步鑒定，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)01是禾谷鐮刀菌，P02是假禾谷鐮刀菌(表3和圖5D)。2021年4月底，將菌株P(guān)01和P02分別接種小麥穗部，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)01和P02都能引起嚴(yán)重的小麥赤霉病(圖5E)。

A：玉米秸稈上子囊殼的形態(tài)特征；B：子囊殼中子囊的形態(tài)特征；C：子囊殼分離菌株在PDA培養(yǎng)基上的表型，P01和P02對應(yīng)的菌株見表3；D：禾谷鐮刀菌特異性引物(左)和假禾谷鐮刀菌特異性引物(右)對子囊殼分離菌株的PCR檢測結(jié)果，1和2分別代表菌株P(guān)01和P02，CK代表陰性對照(H2O)；E：小麥穗部接種子囊殼分離菌株的癥狀。

2.7 小麥赤霉病病原的分離鑒定

2021年6月于小麥成熟期，在同一地塊采集自然發(fā)生的小麥赤霉病病穗進行組織分離和病原菌鑒定，得到HAJ211(H01)～HAJ219(H09)、HAJ21A(H10)、HAJ21B(H11)和HAJ21C(H12)共12種菌株(表3)，分別對這12種菌株進行形態(tài)學(xué)(圖6A)和分子生物學(xué)鑒定(圖6B)，發(fā)現(xiàn)菌株H06和H08為假禾谷鐮刀菌，占 16.67%，其余10株為禾谷鐮刀菌，占83.33%。說明在小麥莖基腐病重病田塊，能夠從發(fā)病的小麥穗部分離到假禾谷鐮刀菌，但假禾谷鐮刀菌的占比較低。

A：小麥赤霉病分離菌株在PDA培養(yǎng)基中的表型，H01～H12對應(yīng)的菌株見表3；B：禾谷鐮刀菌特異性引物(左)和假禾谷鐮刀菌特異性引物(右)對分離菌株的PCR檢測結(jié)果，M代表DL2000，1～12分別代表菌株H01～H12，CK代表陰性對照(H2O)。

3 討 論

在中國，假禾谷鐮刀菌是目前小麥莖基腐病的優(yōu)勢病原菌。據(jù)報道，2009-2013年，在江蘇、安徽、河南和河北省小麥種植區(qū)，小麥莖基腐病的優(yōu)勢病原菌是亞洲鐮刀菌(Fusariumasiaticum)，山東省是禾谷鐮刀菌[22-23]。2013-2016年，在河南、河北和山西省南部地區(qū)，小麥莖基腐病的優(yōu)勢病原菌是假禾谷鐮刀菌；在山東和陜西中部地區(qū)，禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌所占的比例相當(dāng)；在江蘇北部和安徽北部地區(qū)，禾谷鐮刀菌是小麥莖基腐病的優(yōu)勢病原菌[24-26]。本課題組在2016-2019年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，山東省小麥莖基腐病的優(yōu)勢病原菌是假禾谷鐮刀菌。這說明引起中國黃淮地區(qū)小麥莖基腐病的假禾谷鐮刀菌所占的比例在不斷升高，已逐漸成為小麥莖基腐病最主要的病原菌。

目前，由假禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病只在河北省報道過[15-16]。本研究在山東省也發(fā)現(xiàn)了由假禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病，推測假禾谷鐮刀菌可能正在從侵染小麥莖基部擴展為侵染小麥穗部。假禾谷鐮刀菌未能成為小麥赤霉病的優(yōu)勢病原菌，推測可能存在以下幾個因素：第一，子囊孢子是小麥赤霉病的主要初侵染源，禾谷鐮刀菌是同宗配合子囊菌，而假禾谷鐮刀菌是異宗配合子囊菌，在田間兩個交配型的菌株數(shù)量可能差別較大，難以配對形成子囊殼；第二，假禾谷鐮刀菌子囊殼在田間的成熟時間與小麥揚花期錯開，只有少數(shù)子囊殼在小麥揚花期成熟并噴發(fā)；第三，田間環(huán)境條件(溫度、濕度、光照等)不利于假禾谷鐮刀菌形成大量子囊殼。由于黃淮地區(qū)小麥莖基腐病不斷加重，其優(yōu)勢病原菌假禾谷鐮刀菌在土壤中的含量逐漸積累，一旦遇到田間環(huán)境條件的改變以及假禾谷鐮刀菌兩個交配型菌株的均勻分布，形成利于假禾谷鐮刀菌侵染小麥穗部的條件，在小麥莖基腐病嚴(yán)重的地區(qū)可能會發(fā)生由假禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病，需要注意檢測。

研究發(fā)現(xiàn)，小麥莖基腐病的發(fā)生不會在小麥穗部積累過多的毒素，但小麥植株中積累的毒素會對人類及以小麥秸稈為食的動物造成威脅[27]；同時，攜帶病原菌的小麥秸稈還田能夠增加土壤中病原菌的含量。目前尚未見到假禾谷鐮刀菌能夠侵染玉米的報道，但本研究發(fā)現(xiàn)在玉米秸稈上存在禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌的子囊殼，并從中分離出假禾谷鐮刀菌，推測可能是玉米收獲后在秸稈上腐生的，更多關(guān)于假禾谷鐮刀菌在玉米上定植的現(xiàn)象需要進一步的田間觀察才能確定。秸稈還田耕作制度的推廣增加了田間土傳病害病原菌的累積，加重了小麥莖基腐病的發(fā)生[28]，這可能是小麥莖基腐病近年來突然暴發(fā)的重要原因。本研究調(diào)查結(jié)果進一步證明了假禾谷鐮孢菌不僅可以導(dǎo)致小麥莖基腐病，還可以導(dǎo)致小麥赤霉病，從而增加了對小麥生產(chǎn)的威脅。