瀕危藏藥植物波棱瓜雌株的繁育技術研究

央金拉姆 尼珍* 魯躍東 單增白瑪

（1.西藏自治區高原生物研究所，西藏 拉薩 850000；2.南木林鎮農牧綜合服務中心，西藏 日喀則 857100）

波棱瓜（Herpetospermum peduculosum）為葫蘆科，波棱瓜屬一年生攀延草本植物。莖、枝纖細，有棱溝，初時具疏柔毛，最后變近光滑無毛。葉柄長4～8(-10)cm，具與莖枝一樣的毛被，后漸脫落；葉片膜質，卵狀心形，長6～12cm，寬4～9cm，先端尾狀漸尖，邊緣具細圓齒，或有不規則的角，基部心形，彎缺張開，寬、深均為1～2cm，兩面粗糙，初時具黃褐色長柔毛，后漸脫落，葉脈在葉背隆起，具長柔毛；卷須2歧，近無毛。雌雄異株。雄花：通常為單生花同一總狀花序并生，單生花花梗長達10～16cm，具5～10 朵花的總狀花序，長達12～40cm，有疏柔毛；花梗長2～6cm，疏生長柔毛；花萼筒上部膨大成漏斗狀，下部管狀，長2～2.5cm，頂端直徑8～9mm，基部徑2mm，被短柔毛，裂片披針形，長8～9mm；花冠黃色，裂片橢圓形，急尖，長20～22mm，寬12～15mm；雄蕊花絲絲狀，長2～3mm，花藥長5～6mm；退化雌蕊近鉆形，長4～5mm。果梗粗壯，長1～2cm；果實闊長圓形，三棱狀，被長柔毛，成熟時3 瓣裂至近基部，里面纖維狀，長7～8cm，寬3～4cm。種子淡灰色，長圓形，基部截形，具小尖頭，頂端不明顯3 裂，長約12mm，寬5mm，厚2～3mm。花果期6～10月［1］。

波棱瓜在西藏主要分布在波密、林芝、錯那、聶拉木，吉隆、墨脫等地，經本課題組考察，其分布地點增加了4 個縣。另據資料記載，國內主要分布在四川西部、云南西北部、青海。國外主要分布在尼泊爾、錫金、不丹及印度北部等地。從調查情況來看，波棱瓜分布在野外的比較少，大部分生長在農牧民家園的籬笆墻上。

隨著進一步對波棱瓜的研究，發現該物種具有藥用價值，波棱瓜種子含生物堿、鞣質、甾醇、氨基酸、三萜類［2］，其種子入藥，有清熱解毒、柔肝之功效，主要用于治療黃疸型傳染性肝炎以及消化不良等，是常用藏藥材之一。主要生長在海拔1500～3500m 的溫暖、濕潤的亞熱帶路旁、山坡、灌叢、林緣,雖然分布范圍較廣，但在分布區植株密度低。隨著藏醫藥的蓬勃發展，使波棱瓜野生資源瀕臨滅絕。2005年西藏自治區藏醫藥領域的專家們共同確定波棱瓜為一級瀕危植物。在人工栽培中常用種子播種法，波棱瓜是雌雄異株植物，至今從其種子上無法辨認雌、雄株。在常規播種條件下，種子發芽率較低且雌株比例只占30%，因此，產量很低，造成了波棱瓜人工栽培的瓶頸，嚴重制約著規模化栽培。目前，有關波棱瓜組織培養方面見葉片愈傷誘導和頂芽誘導的報道，未見雌株繁殖方面的報道［3］，因此，研究波棱瓜雌株的繁殖技術具有非常重要的意義。本實驗以瀕危藏藥植物——波棱瓜雌株的莖段為外植體進行再生植株的研究，已培養出大量的波棱瓜雌株組培苗并進行了煉苗、移栽、采收，為提高波棱瓜產量開辟了一條行之有效途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采自西藏林芝地區八一鎮西藏藥業藥材栽培基地的波棱瓜子，千粒重為70～110g。通過溫室內播種、移栽，待開花可識別波棱瓜雌、雄株時，剪取波棱瓜雌株上端幼嫩葉片及莖段。先用肥皂水分別進行清洗再用流水反復沖洗，再放入75%的酒精中浸5s 后，用無菌水沖洗3遍，然后用0.1%升汞分三個時間段進行消毒，最后用無菌水清洗三遍以上待用。

1.2 培養條件與方法

實驗以MS、N6為基礎培養基，附加30 g／L蔗糖，6 g／L瓊脂，0.1 g／L 肌醇，pH 5.8。

培養條件：培養溫度為22℃±2；、每天照明12h，采用固體培養。

方法：準備好的材料在超凈臺用無菌濾紙吸干表面水分，將葉片剪切成5 mm×5mm 大小的方塊；莖段切成長約2cm左右，分別接入培養基中。

2 結果與分析

2.1 實驗材料分析

葉片、莖段分別接種到MS 培養基中，培養2d 后葉片開始向外卷曲.一周左右，葉片的四周均有愈傷組織生成。培養到20d 愈傷組織呈黃白色或黃綠色，各瓶中愈傷組織的數量和質量有明顯差異，總的白化現象嚴重。到30d死亡率達到了100%.

莖段培養一周后，莖段有明顯的生長現象，且有新葉長出，培養到20d莖段和莖段上的新葉均出現白化現象，到30d莖段的死亡率為70%.實驗結果表明：莖段和葉片在組織培養過程中都會出現白化現象，但葉片的白化現象更為嚴重。因此選擇莖段培養優于葉片培養。

2.2 MS、N6 培養基對波棱瓜雌株分化的影響

將莖段轉入N6 培養基和MS培養基中，培養一周后，N6 培養基中的莖段有生長現象，長勢一般，培養到20d出現嚴重白化現象，通過調節光照、溫度等方法試圖解決，但未得到改善，30d 死亡率達到100%.而在MS 培養基中，莖段有明顯的生長現象，且有新葉長出，培養到20d 時，出現白化現象，30d 死亡率達到70%，明顯低于在N6 培養基中的莖段。由表1結果表明，MS培養基優于N6培養基。

表1 MS、N6 培養基對波棱瓜雌株分化的影響

2.3 不同配比的蔗糖對波棱瓜雌株的影響

波棱瓜雌株組織培養過程中出現的白化現象，是因為碳源不足引起的。植物缺鐵時影響葉綠素的合成，典型的癥狀是在葉片的葉脈間和細胞網狀組織中出現失綠現象，碳源不僅影響植物的生長速度、生長量，還影響其代謝水平，以及細胞的形態和發生。而蔗糖是組織培養中最常用的碳源。本實驗通過研究蔗糖不同配比對波棱瓜雌株白化現象的影響。由表2 結果表明,將莖段接種到MS 培養基通過增加蔗糖的含量，隨著蔗糖濃度逐步升高在一定范圍內葉片與莖段有返青現象，白化現象得到明顯的改善。以附加40g／L 蔗糖濃度的培養基為宜，白化率有效降低。

表2 培養基中不同配比的蔗糖對波棱瓜雌株的影響

2.4 不同激素配比對波棱瓜雌株分化芽的影響

從表3 可以看出，含有6-BA 和NAA 兩種不同激素在不同濃度配比組合下，隨著6-BA 濃度逐步升高在一定范圍波棱瓜雌株分化芽有明顯增加作用，但6-BA 和NAA 總的激素濃度超過1.5mg／L時，葉片開始出現微微卷曲。而隨著NAA 濃度逐步升高在一定范圍波棱瓜雌株分化芽有增加作用但不明顯，且NAA和6-BA 總的激素濃度超過1.5mg／L 時，葉片生長依然正常，這表明6-BA 起著決定性的作用。分化培養基添加6-BA1.0 mg／L為宜，芽的增殖系數為5.0。

表3 不同激素配比對波棱瓜雌株分化芽的影響

2.5 不同激素配比對波棱瓜雌株生根的影響

切下長1.5～2cm分化芽接種于含有IBA 和IAA 兩種不同激素在不同濃度配比組合下的培養基中，由表4 結果表明，在添加IBA1.0mg／L、IAA1.0mg／L 濃度的1/2MS 生根培養基中，生根時間及整齊度為最優。生根率可達到98%左右。

表4 不同激素配比對波棱瓜雌株生根的影響

圖1 波棱瓜雌株組織培養分化苗

圖2 波棱瓜雌株組織培養生根苗

2.6 試管苗移栽試驗

在移栽前，首先進行幼苗篩選將腐爛、發霉、有病蟲害及機械損傷的苗子除去。選擇健壯、無病蟲感染、葉表面光滑，株高10cm左右的優質種苗。

2.6.1 基質選擇：基質以田園土、紅景天渣、羊糞7：2：1配制基質后裝盆待用。

2.6.2 煉苗：將帶有3～4 條根的組培苗從三角瓶取出洗凈后立即栽入盆中，澆足水，要保持70%的濕度，成活率可達到75%.

2.6.3 田間移栽：煉苗21d 后進行田間移栽。田間移栽時間在5月初到5月下旬進行，天氣為陰天，將苗子小心從營養缽中移出，注意不要抖掉土壤，放入小坑內，移栽后及時澆透定根水，加遮陽網緩苗10d左右。

2.6.4 田間管理：移栽后30d進行第一次中耕除草，以后的生長期根據雜草多少隨時進行除草。當波棱瓜苗高25cm以上時，需要搭架作業，每2～3行搭架一組，搭架高度2m 以上，以人字形為主。要求搭架材料表面粗糙，易于波棱瓜莖須的攀爬。波棱瓜苗期喜陰涼潮濕的環境，生長期間要注意灌溉保濕，但灌水不可太多，防止引起根的腐爛。移栽后30d 進行第一次除草，以后的生長期根據雜草多少隨時進行除草。開花期光照要充足，株間通風要良好。

3 討論

波棱瓜雌株組織培養實驗材料的選取實驗表明莖段培養優于葉片培養；基礎培養基的選擇以MS 為基礎培養基為宜；分化培養基以添加6-BA1.0 mg／L為宜，芽的增殖系數可達到5.0；生根培養基以1/2MS+1.0mg／L IBA +1.0mg／L IAA 為宜，生根率達到98%;增加蔗糖的濃度能有效地解決在組培過程中的出現的白化現象.通過組織快繁技術進行波棱瓜雌株的繁殖是提高雌株比例，解決波棱瓜人工栽培中產量低這一瓶頸的有效途徑之一。

通過組織快繁技術可以成功的繁殖出波棱瓜雌株苗。通過煉苗、移栽后成活率為50%、株高60cm,開花率為35%、結實率為29%。但在栽培過程中植株長勢比野生的弱，株高只有野生的1/2，開花率、結實率均不高。以波棱瓜的生長特性，應在每年的三月底四月初就要開始進行相關栽培工作，分析上述問題可能與移栽時間較晚等原因有關，有待于進一步研究論證。