基于膜技術的桑葚多糖分級分離及生物活性組分篩選

袁心田，陳華國，趙 超，龔小見，周 欣,

（1.貴州中醫藥大學藥學院，貴州貴陽 550002；2.貴州師范大學，貴州省山地環境信息系統與生態環境保護重點實驗室，貴州貴陽 550001；3.貴州師范大學，貴州省藥物質量控制及評價技術工程實驗室，貴州貴陽 550001）

桑葚（Mori fructus）為桑樹的成熟果實，屬于桑科植物桑（Morus albaL.）的果穗。桑葚味甘性寒，酸甜汁多，入心、肝、腎經，為常食的水果之一，被收錄于中國“藥食同源”目錄和《中國藥典》2020版，具有補肝益腎、生津潤燥、烏發明目、利尿、保健和消暑等功效[1]。現代研究表明，桑葚中含有多種維生素、蛋白質、游離氨基酸、有機酸和微量元素等營養成分和多酚類、多糖、生物堿、類胡蘿卜素等多種活性成分[2-3]。桑葚多糖（Mori fructuspolysaccharide，MFP）是桑葚中主要活性成分之一，具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、保護肝臟等多種生物活性[4]。

隨著對多糖構-效關系的深入研究，多糖的生物活性受到其相對分子量、單糖組成、糖苷鍵類型、分子支鏈分支度及化學修飾等影響[5]。不同分子量對多糖的生物活性有一定的影響[6]，而篩選出活性較好的分子量范圍有利于提高多糖的利用度，開發出活性更好的多糖。目前常用的多糖分級技術為柱層析法和分級醇沉法[7]，而利用膜技術對多糖進行分級，可以提高分級效率、控制多糖分子量范圍，并且確保多糖的結構和純度不受化學試劑的影響。蔡銘等[8]采用膜技術分級分離靈芝多糖，發現3種粗多糖均有一定的抗氧化能力，其中GLP100的羥自由基和DPPH自由基清除能力好于其他兩種多糖，GLP1的ABTS+自由基清除能力比其他兩種多糖效果更好。崔婷婷等[9]利用膜技術分級分離鎖陽多糖，發現在50～100 kDa分子量范圍的鎖陽多糖有更好的抗氧化活性。

目前對于桑葚多糖分級常用的方法為柱層析法[10-11]和分級醇沉法[12]。暫無文獻采用膜技術對桑葚多糖進行分級，且無研究表明不同分子量的桑葚多糖具有生物活性的差異。所以本實驗采用膜技術對桑葚多糖進行分級，對不同分子量的桑葚多糖的主要化學成分進行測定，以及對不同分子量的桑葚多糖進行活性篩選。通過以上研究為后期桑葚多糖分級技術的改進升級和桑葚多糖生物活性的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚干品 購買于貴州中醫藥大學第一附屬醫院，產品批號210702，四川博仁藥業有限責任公司；葡萄糖（純度≥98%）、葡萄糖醛酸（純度≥96%） 上海西寶生物科技股份有限公司；苯酚、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）、焦磷酸鈉 上海凜恩科技發展有限公司；牛血清蛋白、α-葡萄糖苷酶（酶活力1 kU）、阿卡波糖、α-淀粉酶（酶活力1 KU）、木瓜蛋白酶（酶活力100 kU/g）、可溶性淀粉、透明質酸酶、透明質酸鈉、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）、乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH） 北京索萊寶科技有限公司；濃硫酸 國藥集團化學試劑有限公司；水楊酸、硫酸亞鐵、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、無水乙醇 天津市致遠化學試劑有限公司；抗壞血酸（Vitamin C，VC） 天津博迪化工股份有限公司；四硼酸鈉 天津市永大化學試劑有限公司；考馬斯亮藍 上海藍季生物科技發展有限公司；咔唑 上海麥克林生化科技有限公司；以上試劑 均為分析純。

HC-GL1812-1X多功能膜分離實驗系統 成都和誠過濾技術有限公司；XS105DU METTLER TOLEDO十萬分之一電子天平 國際貿易（上海）有限公司電子天平；Max Plus 384光吸收酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司酶標儀；FD-80冷凍干燥機

北京博益康醫院實驗儀器有限公司；RE-2000旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 取一定量的桑葚，70 ℃烘干，用粉碎機粉碎，過40目篩后得到桑葚干粉。以石油醚為溶劑，采用冷卻回流法脫脂，料液比1:2 g·mL-1，脫脂2次，每次2 h，溫度65 ℃，濾渣為脫脂桑葚樣品，備用。

1.2.2 桑葚多糖的提取與純化 參考譚西[13]的提取方法，并進行一定的修改。取200 g的脫脂桑葚樣品，以水為溶劑，在熱水（90 °C）中浸提2 h，料液比1:15 g·mL-1。對濾液離心（轉速4000 r·min-1，10 min）和減壓過濾后保存濾液，對濾渣以相同條件進行熱水浸提。反復2次并合并濾液，最后用旋轉蒸發儀濃縮濾液至1000 mL左右得到濃縮液。參考王倩等[14]采用三氯乙酸+木瓜蛋白酶法進行脫蛋白，并進行一定的修改。向濃縮液中加入3%三氯乙酸溶液，體積比1:1，室溫放置20 min，離心收集上清液。調節上清液pH至6～7，加入3%木瓜蛋白酶，50 ℃反應45 min，離心（轉速4000 r·min-1，10 min）收集上清液。此過程進行兩次，最終得到桑葚多糖粗提液。

1.2.3 桑葚多糖粗提液的分級分離 取桑葚多糖粗提液，用300 kDa濾膜在0.2 MPa，5.5 L·min-1條件下超濾分級，截留液用旋轉蒸發儀濃縮后按體積比1:4加入乙醇，4 °C下靜置過夜。次日離心（轉速4000 r·min-1，10 min）得沉淀，真空冷凍干燥得多糖，記為MFP300；取300 kDa濾過液，用50 kDa濾膜進行上述操作得多糖，記為MFP50；取50 kDa濾過液，用5 kDa濾膜進行上述操作得多糖，記為MFP5；取5 kDa濾過液，用1 kDa濾膜進行上述操作得多糖，記為MFP1。

1.2.4 桑葚多糖中總糖含量的測定

1.2.4.1 標準曲線繪制 參考論文中的苯酚-硫酸法[13]。標準溶液的配制：準確稱取10.00 mg葡萄糖標準品，將濃度配制為0.1 mg·mL-1。標準曲線的繪制：吸取0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mL葡萄糖標準溶液，用蒸餾水補至0.50 mL，各加入0.30 mL的5%苯酚溶液，迅速加入1.50 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴30 min，冷卻至室溫后，490 nm處測定吸光度A490。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得到葡萄糖標準曲線回歸方程為y=5.172x+0.109，R2=0.999。

1.2.4.2 總糖含量的測定 用1.2.4.1中的方法測定吸光度。桑葚多糖中總糖含量計算公式為：

式中：W為桑葚多糖中總糖含量，%；A為樣品溶液反應后在490 nm處的吸光度；m為稀釋倍數。

1.2.5 桑葚多糖中蛋白質含量的測定

1.2.5.1 標準曲線的繪制 參考論文中的考馬斯亮藍G-250法[13]。標準溶液的配制：準確吸取1 mL 5 mg·mL-1牛血清蛋白，將濃度配制為0.2 mg·mL-1。標準曲線的繪制：吸取0、20、40、60、80、100、120、140 μL牛血清蛋白溶液于試管中，補蒸餾水至200 μL，搖勻，各加入1 mL考馬斯亮藍溶液，搖勻，避光放置10 min，595 nm處測定吸光度值A595。以牛血清蛋白溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得到蛋白質標準曲線回歸方程為y=0.704x+0.2221，R2=0.9928。

1.2.5.2 蛋白質含量的測定 用1.2.5.1中的方法測定吸光度。桑葚多糖中蛋白質含量計算公式為：

式中：Y為桑葚多糖中蛋白質含量，%；A為樣品溶液反應后在595 nm處的吸光度；m為稀釋倍數。

1.2.6 桑葚多糖中糖醛酸含量的測定

1.2.6.1 標準曲線的繪制 參考咔唑-硫酸法[15]。標準溶液的配制：準確稱取10.00 mg葡萄糖醛酸標準品，將濃度配制為0.1 mg·mL-1。標準曲線的繪制：準確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL葡萄糖醛酸標準溶液，加蒸餾水定容至1 mL，冰水浴中加入5 mL四硼酸鈉-硫酸溶液，旋渦混合器混勻，沸水浴20 min，取出后立即冷卻至室溫，加0.15%咔唑溶液0.2 mL，搖勻，室溫反應2 h，523 nm處測定吸光度值A523。以葡萄糖醛酸溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得到糖醛酸標準曲線回歸方程為y=5.2456x+0.1，R2=0.9992。

1.2.6.2 糖醛酸含量的測定 用1.2.6.1中的方法測定吸光度。桑葚多糖中糖醛酸含量計算公式為：

式中：T為桑葚多糖中糖醛酸含量，%；A為樣品溶液反應后在523 nm處的吸光度；m為稀釋倍數。

1.2.7 桑葚多糖中還原糖含量的測定

1.2.7.1 標準曲線的繪制 參考文獻[16]DNS法。標準溶液的配制：準確稱取100.00 mg葡萄糖標準品，將濃度配制為1 mg·mL-1。標準曲線的繪制：精確吸取葡萄糖標準液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，分別置于25 mL試管中，不足1 mL的用蒸餾水補充至1 mL，再加入DNS溶液2 mL，混合均勻后，沸水浴5 min，迅速流水冷卻，加水至刻度線，550 nm測定吸光度值A550。空白調零，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪制標準曲線。得到還原糖標準曲線回歸方程為y=0.3529x+0.0913，R2=0.9993。

1.2.7.2 還原糖含量的測定 用1.2.7.1中的方法測定吸光度。桑葚多糖中還原糖含量計算公式為：

式中：D為桑葚多糖中還原糖含量，%；A為樣品溶液反應后在550 nm處的吸光度；m為稀釋倍數。

1.2.8 不同分子量桑葚多糖的抗氧化活性測定

1.2.8.1 DPPH自由基清除活性測定 DPPH自由基清除活性測定選參考Zhang等[17]的方法，并稍作修改。取3 mL 0.2 mg·mL-1的DPPH乙醇溶液，與2 mL MFP溶液充分混勻，避光靜置20 min后，以無水乙醇作空白調零，517 nm波長測吸光度A517，以蒸餾水代替多糖溶液作陰性對照，VC作陽性對照，DPPH自由基清除率計算公式如下所示。

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A0為空白溶液吸光度；A2為不含DPPH的樣品溶液吸光度。

1.2.8.2 ABTS+自由基清除活性測定 ABTS+自由基清除活性測定參考田義敏[18]的方法。精密稱取38.90 mg ABTS和15.16 mg過硫酸鉀溶液混合，分別用蒸餾水定容至10 mL，按1:1混合后置于4 ℃冰箱中避光反應12～16 h，形成ABTS儲備液。使用前用水稀釋成工作液，使其在734 nm下的吸光度在0.70±0.02。將MFP溶液和ABTS儲備液溶液按1:1體積加入96孔板中，在室溫黑暗條件下反應15 min，以蒸餾水代替多糖溶液作為空白，測定在734 nm下的吸光度A734，VC做陽性對照，ABTS+自由基清除率計算公式如下所示。

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A0為空白溶液吸光度；A2為不含ABTS的樣品溶液吸光度。

1.2.9 不同分子量桑葚多糖的降血糖活性測定

1.2.9.1α-葡萄糖苷酶抑制活性測定α-葡萄糖苷酶抑制活性測定參考龍曉珊[19]的方法，并稍作修改。α-葡萄糖苷酶溶液（0.1 U·mL-1）由PBS緩沖溶液（0.1 mol·L-1，pH6.9）配制。將50 μL MFP溶液和25 μLα-葡萄糖苷酶溶液混合，37 ℃反應10 min，之后加入25 μL對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（1.5 mmol·L-1）。充分混勻后于37 ℃反應30 min，反應結束后加入100 μL碳酸鈉（0.2 mol·L-1）停止反應，在405 nm下測定其吸光度A405，以阿卡波糖作為陽性對照，計算α-葡萄糖苷酶抑制率，抑制率公式如下所示。

式中：A1為樣品溶液得吸光度；A2為不含α-葡萄糖苷酶的樣品溶液吸光度；A0為空白溶液的吸光度。

1.2.9.2α-淀粉酶抑制活性測定α-淀粉酶抑制活性測定參考Chen等[20]方法，并稍作修改。α-淀粉酶溶液（0.5 mg·mL-1）由PBS緩沖溶液（0.1 mol·L-1，pH6.9）配制。將100 μL MFP和100 μLα-淀粉酶溶液混合，37 ℃水浴10 min，加入200 μL 1%可溶性淀粉溶液，37 ℃反應10 min，沸水浴中反應10 min。沸水浴結束后加入200 μL DNS試劑，在沸水浴顯色反應10 min。反應結束后，反應物冷卻至室溫并加入4 mL蒸餾水稀釋，在540 nm處測定吸光度A540，抑制率公式如下所示。

式中：A1為多糖溶液及α-淀粉酶溶液正常反應的吸光度；A2為用緩沖液代替α-淀粉酶溶液時的吸光度；A3為用緩沖液代替多糖溶液時的吸光度；A4為用緩沖液代替多糖溶液及α-淀粉酶溶液時的吸光度。

1.2.10 不同分子量桑葚多糖的透明質酸酶抑制活性測定 透明質酸酶抑制活性采用CTAB濁度法進行測定，參考易曉敏[21]的方法，并稍作修改。以pH6.0，0.2 mol·L-1乙酸-乙酸鈉溶液為緩沖液，用緩沖液配制0.5 mg·mL-1透明質酸酶的溶液及3.44 mg·mL-1透明質酸鈉溶液。取100 μL MFP溶液于10 mL試管中，加入100 μL透明質酸酶溶液，再用緩沖液補充定容至0.9 mL，振蕩均勻后，置于37 ℃的恒溫水浴中，預熱15 min后加入100 μL透明質酸鈉溶液，并開始計時，準確計時10 min，迅速加入4 mL CTAB溶液（以2% NaOH溶液為溶劑配制的2.5% CTAB溶液）終止反應，混合均勻，常溫靜置10 min后測定反應液在405 nm波長下的吸光度A405，抑制率公式如下所示。

式中：A1為多糖溶液及透明質酸酶溶液正常反應的吸光度；A2為用緩沖液代替透明質酸酶溶液時的吸光度；A3為用緩沖液代替多糖溶液時的吸光度；A4為用緩沖液代替多糖溶液及透明質酸酶時的吸光度。

1.2.11 不同分子量桑葚多糖體外乙醇脫氫酶活性測定 乙醇脫氫酶活性采用瓦勒-霍赫法測定，參考了鄧青芳[22]的方法。在酶標板中依次加入100 μL焦磷酸鈉緩沖液（pH8.8）、70 μL 2 mmol·L-1NAD+、35 μL 2 mol·L-1乙醇及20 μL MFP溶液，混勻后，35 ℃下密封溫育5 min，時間到后立即向酶標板中加入20 μL 0.1 U·mL-1ADH，搖勻后立即用酶標儀測定其340 nm處的吸光度A340，每隔10 s讀取1次吸光度值，連續測定5 min，并記錄數據，空白組則是以20 μL蒸餾水代替樣品溶液，其余步驟不變，最后根據公式（10）計算ADH活性、公式（11）計算ADH的抑制（激活）率。

式中：E為ADH酶活性，U·mL-1；E1為樣品組酶活性，U·mL-1；E0為空白組酶活性，U·mL-1；ΔA340為反應最初線性部分340 nm波長處吸光度每1 min的增值；6.2為NAD+在340 nm處的摩爾消光系數。

1.3 數據處理

本文所有實驗數據均重復3次，使用IBM SPSS Statistics 26軟件進行數據處理，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。采用GraphPad Prism 8軟件作圖，實驗結果采用平均值±標準偏差來表示。

2 結果與分析

2.1 不同分子量的桑葚多糖的主要成分分析

采用水提醇沉法從桑葚中提取多糖，并使用多功能膜分離設備對提取液進行分級得到MFP1、MFP5、MFP50和MFP300。四個組分顏色變化由淺到深，MFP1顏色最淺，為紫紅色；MFP300顏色最深，為深紫色。四個組分的主要成分如表1所示。結果表明，MFP5中總糖和糖醛酸含量最高，為68.45%±1.53%和22.78%±2.32%；其次是MFP300，為66.32%±0.70%和21.48%±1.24%；MFP1兩者含量最低，為46.34%±0.73%和3.34%±1.57%。MFP5中還原糖含量最低，為6.03%±3.92%；MFP1中還原糖含量最高，為16.51%±0.83%。蛋白質含量普遍偏低，MFP300含量最高，為3.67%±0.18%，MFP1含量最低，為0.10%±0.08%。桑葚多糖的主要成分含量不是按照分子量大小順序依次降低，且多糖主要集中在MFP5和MFP300兩個組分。四個組分中蛋白質含量較低，說明純化效果較好，蛋白質對活性影響可以忽略。

表1 不同分子量桑葚多糖的主要成分含量Table 1 Contents of main components of MFP with different molecular weights

2.2 不同分子量桑葚多糖的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性 四個組分的DPPH自由基清除活性如圖1a所示，4種多糖均有較好的DPPH自由基清除活性，其中，MFP300在0.1、0.6和1.2 mg·mL-1濃度下清除率最高，且與其他三組多糖相比有極顯著差異（P＜0.01），所以選擇MFP300研究其“量-效”關系，如圖1b所示。MFP300的DPPH自由基清除能力隨濃度的升高而增強。當MFP300濃度為1.2 mg·mL-1時，清除率最大為97.09%±0.14%，與同等濃度下VC對DPPH自由基的清除率無顯著差異（P＞0.05）。MFP300的IC50值為0.2235 mg·mL-1，VC的IC50值為0.005276 mg·mL-1，與錢燕芳等[23]通過超聲提取得到的桑葚多糖相比，MFP300的IC50值較小，表現出較好的DPPH自由基清除活性。

圖1 不同分子量桑葚多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of MFPs of different molecular weight against DPPH free radicals

2.2.2 ABTS+自由基清除活性 四個組分的ABTS+自由基清除活性如圖2a所示，當濃度為0.6 mg·mL-1時，4種多糖的清除率均大于50%，其中MFP300活性最好，在濃度為1.2 mg·mL-1時，MFP300的ABTS+自由基清除率為98.23%±0.54%，與MFP1和MFP5相比有極顯著差異（P＜0.01），與MFP50相比有顯著差異（P＜0.05），所以選擇MFP300研究其“量-效”關系，如圖2b所示。MFP300的IC50值為0.2979 mg·mL-1，VC的IC50值為0.02981 mg·mL-1；在測定范圍內，MFP300對ABTS+自由基的清除率隨濃度先升高后趨于平緩，在1.2 mg·mL-1時與同濃度下的VC無顯著差異（P＞0.05），與Deng等[24]采用酶輔助提取的桑葚多糖相比，MFP300的IC50值更小，表明MFP300有較好的ABTS+自由基清除能力。

圖2 不同分子量桑葚多糖對ABTS+自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of MFPs of different molecular weight against ABTS+ free radicals

多糖是天然高分子多聚物，分子量高低會影響其生物活性。一般而言，低分子量多糖更容易進入生物體內，活性更好；但多糖并非分子量越低活性越好，因為分子量過低，無法形成多糖產生活性的聚合結構[25]。Su等[26]發現木耳多糖的DPPH、ABTS+和羥自由基清除活性與其分子量呈顯著正相關；李小蓉等[27]發現海帶中高分子量的巖藻多糖具有較好的抗衰老活性。與其他組分相比，MFP300分子量較大，可形成較多產生活性的聚合結構，進而表現出較好的DPPH和ABTS+自由基清除能力。

2.3 不同分子量桑葚多糖的降血糖活性

2.3.1α-葡萄糖苷酶抑制活性α-葡萄糖苷酶抑制劑可降低食物中葡萄糖的消化速率，抑制餐后血糖的升高，是防治糖尿病的有效手段之一[28]。如圖3a所示，不同分子量的桑葚多糖對α-葡萄糖苷酶均有一定抑制作用，且有隨著濃度升高抑制率增強的趨勢。在同等濃度對比下，MFP1與阿卡波糖相比均無顯著差異（P＞0.05）；1 mg·mL-1時，MFP1抑制率已超過50%，為63.02%±4.99%，與其他組多糖相比有顯著差異（P＜0.05），故選取MFP1繪制其“量-效”關系曲線，如圖3b所示。MFP1的IC50值為0.7944 mg·mL-1，阿卡波糖的IC50值為0.4050 mg·mL-1，表明阿卡波糖的抑制效果要優于MFP1，但與文獻報道的相比[29]，MFP1的IC50更小。綜上所述，MFP1有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖3 不同分子量桑葚多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.3 Inhibitory activity of MFPs of different molecular weights against α-glucosidase

2.3.2α-淀粉酶抑制活性α-淀粉酶抑制劑可降低食物中淀粉的消化速率，抑制餐后血糖的升高是防治糖尿病的有效手段之一[30]。如圖4a所示，不同分子量的桑葚多糖對α-淀粉酶均有一定抑制作用，且有隨著濃度升高抑制率增強的趨勢。與其他三組多糖相比，MFP1表現出更強的抑制活性：5 mg·mL-1時，MFP1的抑制率超過50%，為69.51%±2.23%；10 mg·mL-1時，MFP1的抑制率極顯著地高于其他三組多糖和阿卡波糖的抑制率（P＜0.01），所以選取MFP1研究其“量-效”曲線如圖4b所示。MFP1的IC50值為4.6419 mg·mL-1，阿卡波糖的IC50值為1.5916 mg·mL-1，表明阿卡波糖的抑制效果要優于MFP1，但與已有文獻相比[29]，MFP1的IC50更小。結果表明，MFP1有較好的α-淀粉酶抑制活性。

圖4 不同分子量桑葚多糖對α-淀粉酶的抑制能力Fig.4 Inhibitory ability of MFPs of different molecular weights on α-amylase

2.4 不同分子量桑葚多糖的抗過敏活性

透明質酸酶是降解透明質酸的水解酶，是機體結締組織細胞外基質的主要成分，與大多數由IgE介導的I型和T細胞介導的IV型過敏反應有關，因此，透明質酸酶體外抑制實驗是體外快速篩選抗過敏藥物的有效方法[31]。如圖5a所示，不同分子量的桑葚多糖對透明質酸酶均有一定的抑制作用。其中，MFP300的抑制率隨濃度增大而升高，且在1.2 mg·mL-1時，抑制率為53.9%±5.87%，與其他三組有顯著差異（P＜0.05），所以選取MFP300研究其“量-效”關系，如圖5b所示。MFP300的透明質酸酶抑制能力的IC50值為0.6634 mg·mL-1，表明MFP300有較好的抗過敏活性。

圖5 不同分子量桑葚多糖對透明質酸酶的抑制能力Fig.5 Inhibitory ability of MFPs of different molecular weight on hyaluronidase

2.5 不同分子量桑葚多糖的體外乙醇脫氫酶活性

ADH是一種肝臟中重要的代謝酶，它能利用NAD+作為輔助性因子催化乙醇氧化生成還原型輔酶I（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和相應的羰基化合物，這是哺乳動物肝臟酒精代謝的限速步驟[13]。因此，通過檢測ADH體外活性來評價活性物質對肝臟的保護作用具有重要意義。如圖6a所示，大部分桑葚多糖在體外表現出激活ADH活性。盡管MFP300在低濃度中表現出抑制ADH活性，但其在中和高濃度表現出較好的激活ADH活性，與其他三組相比有顯著差異（P＜0.05），故選取MFP300研究其“量-效”關系，如圖6b所示。MFP300對ADH的激活能力的IC50為10.2646 mg·mL-1，這與文獻報道的不同[32]，這可能是提取和純化工藝不同導致的。

圖6 不同分子量桑葚多糖的乙醇脫氫酶活性Fig.6 Alcohol dehydrogenase activity of MFPs of different molecular weight

3 討論與結論

分子量是影響多糖生物活性的一個重要因素，而不同來源的多糖產生生物活性的最佳分子量范圍不同[33]。朱曉冉等[34]發現小分子量（分子量＜30 ku）的黑木耳多糖的抗氧化活性更好；Xu等[35]利用H2O2對黑加侖多糖進行降解，得到DBCP-1（1.3×104kDa）和DBCP-2（9.62×103kDa）兩種低分子量多糖，并發現降解后的多糖比未降解的多糖有更好的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性。

本實驗采用300、50、5和1 kDa四種不同孔徑超濾膜對桑葚多糖進行分級。不同分子量段多糖的主要成分有明顯的不同，MFP1、MFP5、MFP50和MFP300的總糖含量分別為46.34%、68.45%、48.60%和66.32%，糖醛酸含量分別為3.34%、22.78%、16.11%和21.48%，還原糖含量分別為16.51%、6.03%、7.90%和6.67%。此外，體外生物活性表明，MFP300的抗氧化、抗過敏和ADH活性最好，而MFP1的降血糖活性最好，這表明分子量大小會影響桑葚多糖的生物活性。綜上所述，本實驗利用不同孔徑濾膜對桑葚提取液進行處理，多糖的主要化學成分和生物活性差異說明膜技術在桑葚多糖分級分離中的應用是有效的，為桑葚多糖的分級分離提供了一種新的思路，也為桑葚多糖的生物活性測定提供理論及實驗基礎。