谷氨酰胺轉氨酶對蕎麥分離蛋白凝膠特性的影響

孫樂常，王 瑜，翁 凌，劉 明，繆 松,3,5，劉光明，曹敏杰,

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建廈門 361021；2.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，大連工業大學，遼寧大連 116034；3.水產品深加工技術國家地方聯合工程研究中心，福建廈門 361021；4.國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037；5.愛爾蘭農業部農業與食品發展局Teagasc食品研究中心，芒斯特科克 999014）

蕎麥（Fagopyrum esculentumMoench.）是蓼科蕎麥屬的一種雙子葉植物，多種植于內蒙古、陜西、山西、甘肅、寧夏等一些高寒地帶，在我國糧食種植生產中占有重要地位。蕎麥中的類黃酮、膳食纖維、肌醇、植物類固醇等生物活性物質，對癌癥、高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、高脂血癥等疾病均有預防與輔助治療作用[1]。隨著社會的發展，人們的飲食結構逐漸傾向于健康、綠色、原生態的保健型食品，蕎麥憑其較高的營養價值和保健功效，越發受到人們的青睞。

蕎麥主要被加工成蕎麥面粉用于生產面類制品，如蕎麥面條、蕎麥饅頭等。蕎麥蛋白是主要的加工副產物，占蕎麥含量的16%左右[1]。蕎麥蛋白中必需氨基酸組成均衡，賴氨酸豐富，含有多種維生素和磷、鈣、鐵等微量元素，其蛋白生物價為93.1%，遠高于大豆蛋白（68.4%）和小麥蛋白（62.5%），極具開發利用價值[1]。在分離制備蕎麥蛋白過程中，不同的加工方式對蕎麥蛋白特性具有不同影響。米宏偉等[2]研究了加工工藝對蕎麥蛋白的影響，發現超聲協助提取和脫脂處理分別提高了蛋白的溶解度和乳化性，而冷凍干燥蕎麥分離蛋白的持水和持油性能高于噴霧干燥處理。同時，米宏偉等[3]還研究了TGase對蕎麥蛋白的影響，發現適當添加的TGase能有效提高蕎麥蛋白的持水力、持油力、起泡性與乳化穩定性，但蛋白的乳化活性指數卻下降了。Xue等[4]通過結合高強度超聲處理與葡聚糖基化修飾對蕎麥蛋白進行改性，發現相較于傳統加熱方式，蕎麥蛋白的表面疏水性顯著提高且乳化性也得到了改善。

除此之外，植物蛋白自身也具有一定的凝膠性，還能與動物肌原纖維蛋白產生良好的協同作用，提高肉糜凝膠的保水性和熱穩定性，廣泛應用于肉糜制品等凝膠類食品領域[5]。與動物肌肉肌原纖維蛋白凝膠不同，植物蛋白的凝膠化主要以球蛋白為主體，其凝膠能力與植物自身蛋白的結構相關，且形成的凝膠較弱，通常需要采用一定的改性方法對植物凝膠進行質構改良[6-7]。左鋒等[8]研究了乙酰化改性對蕓豆分離蛋白凝膠特性的影響，發現乙酰化處理增強了凝膠形成過程中蛋白質分子相互作用，顯著提高了凝膠的硬度、彈性和內聚性。相對于化學法改性，通過酶法改性提升蛋白的功能特性不僅條件溫和、可控，還具有更高的安全性。TGase是凝膠中常用的食品添加劑，能催化蛋白分子間的谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基和賴氨酸殘基的ε-氨基交聯形成牢固的共價鍵，進而提高凝膠特性[9]。Nonaka等[10]研究了TGase對熱誘導大豆蛋白凝膠的物理性質的影響，發現1%TGase能夠提高凝膠的硬度和凝膠強度，并在一定程度上抵抗高鹽對蛋白質凝膠網絡的破壞。Zhan等[11]發現TGase處理的豌豆分離蛋白乳狀凝膠具有更加致密、保水性更強的內部結構。然而，不同種類的植物雖然均以球蛋白為凝膠主體，但各自的凝膠特性存在明顯差異。迄今為止，圍繞蕎麥蛋白功能特性的研究主要集中乳化性、溶解性以及持水性等方面，而關于加工方式與TGase對蕎麥蛋白凝膠特性的影響卻未見報道。

本文通過堿溶酸沉的方法制備蕎麥分離蛋白，分別利用噴霧干燥與冷凍干燥制備獲得蕎麥蛋白，并研究TGase對蕎麥蛋白理化特性與凝膠特性的影響，旨在闡明蕎麥蛋白凝膠化機理，以期為蕎麥蛋白的開發與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥 福建省廈門市集美區新華都購物超市；8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS） 美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）用標準蛋白 美國Thermo Fisher Scientific公司；考馬斯亮藍R-250 福建興隆達公司；谷氨酰胺轉氨酶 中國東恒華道生物科技有限公司；β-巰基乙醇 上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉、尿素、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉等 均為分析純級。

HG-200均質機 臺灣祥泰公司；pH計 德國Sartorius公司；SW23振蕩恒溫水浴槽 北京優萊博技術有限公司；Avanti J-26S XP高速冷凍離心機美國Beckman公司；Alpha 1-4 LDplus冷凍干燥機

德國Christ公司；Mini-PROTEAN蛋白質電泳裝置 美國Bio-Rad公司；凝膠成像儀 英國Syngen公司；FP-8200熒光分光光度計 日本Jasco公司；DHR-2流變儀 美國TA儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 干燥方式對蕎麥分離蛋白理化特性的影響

1.2.1.1 蕎麥分離蛋白制備及干燥 利用破壁機將蕎麥制成蕎麥粗粉，采用等電點沉淀法[2]制備分離蛋白。稱取一定質量蕎麥粉，加入15倍體積的蒸餾水后，將溶液的pH緩慢調節至8.0。在室溫下用磁力攪拌器提取3 h，使蕎麥中的蛋白質充分溶解。將懸濁液于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，8000×g離心20 min收集上清液。用1.0 mol/L鹽酸將收集到的上清液pH調至4.5，使其靠近蕎麥分離蛋白的等電點。攪拌10 min使蛋白質充分析出。離心收集沉淀，即為蕎麥分離蛋白（BPI）。用少量蒸餾水將沉淀溶解，并將pH調至中性，置于4 ℃環境下貯存備用。

蕎麥分離蛋白分別采用冷凍干燥及噴霧干燥的方法進行后續處理，分別命名為FBPI和SBPI，收集置于密封保鮮袋中備用。噴霧干燥工藝參數為：進風溫度160 ℃，出風溫度95 ℃，流速8 r/min；真空冷凍干燥工藝參數為：溫度45 ℃，真空度0.63 MPa。

1.2.1.2 SDS-PAGE分析 將不同蛋白樣品溶解于離子水中使蛋白終濃度為1 mg/mL。蛋白樣品經過SDS化后取10 μL上樣于15%的聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE。待電泳結束后，用考馬斯亮藍R-250溶液對膠片進行染色，再用甲醇-冰乙酸溶液脫色。

1.2.1.3 二級結構 使用去離子水將不同BPI溶液稀釋成0.1 mg/mL，用Chirascan圓二色譜儀進行靜態掃描分析。光譜的掃描范圍為200～280 nm，掃描速度為10 nm/min，比色皿光徑為1 mm。

1.2.1.4 疏水性 根據許英一等[12]的方法，以ANS為熒光探針，使用熒光光譜儀進行表面疏水性測定。以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.5）為溶劑，分別將BPI及干燥后的蛋白粉配制成濃度為0.025、0.005、0.1 mg/mL的溶液。取2 mL樣品于試管中并加入20 μL ANS溶液（8 mmol/L），混勻后避光靜置20 min，測定熒光值。測試所用激發波長為390 nm，發射波長為470 nm，狹縫寬為10 nm。空白對照為磷酸鹽緩沖液和ANS的混合溶液。以測得的熒光強度作為因變量，蛋白濃度作為自變量，繪制曲線，分別計算曲線初始階段的斜率，即為所求的H0。蛋白濃度用Bradford法[13]進行測定。

1.2.1.5 內源性熒光 將樣品溶于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.5）中并將濃度調整為0.1 mg/mL。利用熒光分光光度計測定樣品的FI，并將結果進行平滑處理優化。測試所用激發波長為295 nm，發射波長為300～500 nm，狹縫寬2.5 nm。

1.2.1.6 溶解度 溶解度測定參考Latorres等[14]的方法并做適當修改。配制pH分別為2.0、4.0、7.0與10.0的0.1 mg/mL的蛋白溶液，在低溫環境下攪拌30 min使其充分溶解，經7500×g離心15 min后，通過Lowry法測定上清液和全蛋白含量。全蛋白含量用可溶化液（20 mmol/L PBS，2% SDS，8 mol/L Urea，pH8.0）充分溶解后的樣品中所含的蛋白含量表示。溶解度計算公式如下：

1.2.1.7 持水力 不同干燥方式的分離蛋白持水力的測定參考李明娟等[15]的方法并作一定的修改。稱取0.5 g的分離蛋白置于離心管中，總重為m1。加入5 mL的蒸餾水，混勻后室溫靜置30 min。靜置后的樣品經3000×g離心10 min，去除水層，離心管總重記為m2。持水力計算公式如下：

1.2.2 TGase對蕎麥分離蛋白凝膠特性的影響

1.2.2.1 蛋白凝膠制備 將冷凍干燥和噴霧干燥制備的蕎麥蛋白分別溶于去離子水中配成濃度為20%的溶液，記為F-G和S-G。TG組的樣品為含1:100（蛋白粉:酶，w/w）TGase的20%蕎麥蛋白溶液，記為F+TG-G和S+TG-G，室溫下用磁力攪拌器充分攪拌2 h。從各個樣品中取一部分在90 ℃加熱25 min，然后立即在冰水混合物中冷卻待用。

1.2.2.2 粒徑與電位 通過Zetasizer Nano ZS90測量BPI和未加熱樣品溶液的粒徑和電位。樣品使用10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.5）稀釋為0.5 mol/L，以避免在測量過程中發生多次散射。在25 ℃下對每個樣品進行多次重復測量取平均值。

1.2.2.3 動態溫度掃描 取適量蛋白溶液于流變儀平板上，所選夾具為40 mm平板，樣品與夾具縫隙處滴加一層硅油，防止加熱過程中樣品水分揮發。25 ℃平衡180 s，溫度范圍為25～90 ℃，加熱速率為2 ℃/min，頻率1 Hz，應變振幅為1%，在樣品的線性黏彈性區域范圍內。記錄每個樣品的儲能模量（G'）和耗能模量（G''）。

1.2.2.4 頻率掃描 取適量蛋白溶液于流變儀平板上，所選夾具為40 mm平板，樣品與夾具縫隙處滴加一層硅油，防止加熱過程中樣品水分揮發。先在90 ℃加熱25 min，隨后恢復室溫25 ℃。掃描頻率范圍為0.01～10 Hz，應變振幅為1%，在樣品的線性黏彈性區域范圍內。記錄每個樣品的儲能模量（G'）和耗能模量（G''）。

1.2.2.5 化學鍵 蕎麥凝膠化學鍵測定參考胡曼子等[16]的方法，采用以下不同的反應溶液對凝膠進行處理：SA，0.05 mol/L NaCl；SB，0.6 mol/L NaCl；SC，0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素；SD，0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素；SE，0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/Lβ-巰基乙醇。將2 g凝膠加入以上溶液10 mL并在勻漿機均質30 s。均勻分散的混合物在搖床上以220 r/min在室溫下振蕩2 h，然后在10000×g離心10 min。取20 mL適當稀釋的樣品加入50 mL Bradford試劑在室溫下反應5 min，測定412 nm處的吸光度。SB與SA的差值為離子鍵；SC與SB的差值為氫鍵；SD與SC之間的差值為疏水相互作用；SE和SD之間的差值為二硫鍵。

1.3 數據處理

所有數據重復三次取平均值，并以均數±標準差計算。采用SPSS19.0軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）進行統計分析，采用Duncan多重比較差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 干燥方式對蕎麥分離蛋白理化特性的影響

2.1.1 SDS-PAGE分析 圖1為蕎麥分離蛋白的蛋白質組成，主要由分子量為60 kDa左右的13S球蛋白亞基和17 kDa的2S清蛋白組成[17]。蕎麥13S球蛋白分子量由 6 個亞基組成，可以看出13S球蛋白為提取的蕎麥分離蛋白的主要組成部分。在還原條件下，蕎麥分離蛋白中的13S球蛋白亞基會斷裂為分子量為32～36 kDa的酸性多肽和22 kDa的堿性多肽，證明其是通過二硫鍵連接組成球蛋白大分子[17]。相比于冷凍干燥蛋白，噴霧干燥的蕎麥蛋白在非還原條件下13S球蛋白亞基條帶發生降解，同時

圖1 蕎麥分離蛋白的蛋白質組成Fig.1 Protein of buckwheat protein isolates

產生了一個分子量大約為35 kDa的新條帶，這可能是由于噴霧干燥過程中的熱處理使一部分13S球蛋白亞基的二硫鍵斷開，同時受熱使得含有巰基的蛋白內部重新組合連接，因而產生了35 kDa的新條帶。

2.1.2 二級結構 圓二色光譜可以在較接近蛋白質生理狀態的液體環境中測定蛋白質二級結構，已廣泛應用于蛋白質的構象研究[18]。圓二色性在遠紫外區（185～245 nm）的吸收信號來自于肽鍵，可以反映主鏈的構象，表征蛋白質的二級結構[18]。干燥過程中的一些物理條件，如噴霧干燥過程中的霧化和瞬時高溫，以及冷凍干燥過程中的凍結和升華，都有可能使蛋白質產生構象變化，改變蛋白質分子的二級結構[19]。如圖2所示，兩種干燥蛋白在195～220 nm波長處均有負峰，在206 nm處出現正峰，分別代表了蛋白質的α-螺旋與β-轉角結構[20]。α-螺旋結構表現蛋白質分子結構的有序性，而其他結構如β-轉角、無規卷曲等則反映了蛋白質分子的松散、不規則性[21]。結合表1可知，BPI的α-螺旋、β-轉角、無規卷曲含量分別為25.80%、18.50%、36.80%。相比于BPI，FBPI和SBPI的α-螺旋含量減小至22.10%和20.00%，β-轉角的含量增至19.40%和19.80%，無規卷曲含量增至40.50%和43.80%，分子結構的有序性降低。FBPI在冷凍干燥過程中由于水分的升華使各溶質組分濃縮，體系中離子濃度的增加，進而可能使蛋白質分子部分變性，其二級結構發生改變[22]。相比之下，SBPI在噴霧干燥中的瞬時高溫則會使蕎麥蛋白中熱敏感蛋白發生變性，使其中的部分α-螺旋與β-折疊結構發生了改變，形成了新的β-轉角結構，蛋白從有規則的結構向無規則結構轉化。閆潔等[23]在研究大豆蛋白時也發現了類似現象，通過紅外光譜研究噴霧干燥和冷凍干燥大豆蛋白的二級結構，發現兩種干燥方式均造成了β-折疊和無規卷曲的降低以及β-轉角含量的大幅上升，其中冷凍干燥由于對大豆蛋白二級結構的破壞較小，蛋白還具有良好的凝膠能力，而噴霧干燥使大豆蛋白過度變性從而失去凝膠能力。

圖2 蕎麥分離蛋白的圓二色光譜Fig.2 Circular dichroism spectrum of buckwheat protein isolates

表1 蕎麥分離蛋白的二級結構含量（%）Table 1 Secondary structure content of buckwheat protein isolates (%)

2.1.3 疏水性與內源熒光性 疏水性探針ANS能夠通過靜電相互作用與蛋白質暴露的疏水區域結合，使結合區域的熒光強度顯著增加，其熒光值可以反映蛋白質分子表面疏水性[24]。如圖3所示，BPI的表面疏水性指數為242.94，干燥處理后FBPI和SBPI的疏水性指數分別增至269.02和309.05。冷凍干燥的蛋白樣品由于長時間暴露在中等高溫下（冷凍干燥過程中的二次干燥）會發生冷變性，導致包埋在內部的疏水性區域暴露，表面疏水性增加[25]。SBPI的表面疏水性較大，這可能是由于在噴霧干燥過程中，瞬時的高溫干燥給分離蛋白帶來了不可逆的結構破壞，使更多的非極性基團暴露在蛋白質表面，導致疏水性較高。鄧芝串等[26]發現噴霧干燥籽瓜種子蛋白的表面疏水性大于冷凍干燥，與本實驗的結果一致。

圖3 蕎麥分離蛋白表面疏水性Fig.3 Surface hydrophobicity of buckwheat protein isolates

如圖4所示，FBPI和SBPI的內源性熒光強度大于BPI。冷凍干燥直接將蕎麥分離蛋白中的水由固態升華脫出，在此過程中蛋白會因離子強度的改變發生冷變性，導致芳香性氨基酸殘基暴露；除此之外，冷凍干燥樣品內部結構較為疏松，避免了側鏈的芳香族氨基酸殘基被掩埋，內源性熒光增加[15]。經過噴霧干燥的分離蛋白由于高溫變性的影響，將使埋藏在內部的原有芳香族氨基酸殘基暴露，也會使內源性熒光增強。

圖4 蕎麥分離蛋白內源性熒光Fig.4 Endogenous fluorescence of buckwheat protein isolates

2.1.4 溶解性與持水力 如圖5所示，FBPI和SBPI的溶解度均在pH4處有最小值，為54.01%和46.90%，在pH10處有最大值，溶解度分別為84.92%和81.96%。pH4接近蕎麥分離蛋白等電點，此時蛋白質的凈電荷接近零，分子間的靜電斥力減小，蛋白質容易產生聚集沉淀，進而溶解度降低；遠離等電點時，蛋白中所帶的凈電荷增加，分子間的靜電斥力增加，溶解度升高[27]。與SBPI組相比，FBPI在各pH溶液中溶解性更好，這可能是由于SBPI較高的表面疏水性（圖3）導致的。此外，胡方洋等[28]研究了不同干燥方式對苦蕎蛋白功能性質的影響，發現冷凍干燥樣品蛋白質樣品疏松的內部結構，能夠更好地與水形成氫鍵作用，進而使溶解度增大。另一方面，噴霧干燥還會使蛋白表面形成高抗濕薄膜[29]，會阻礙水分子進入蛋白分子內部，這可能也是本實驗中SBPI溶解性較差的原因。

圖5 蕎麥分離蛋白的溶解性Fig.5 Solubility of buckwheat protein isolates

蛋白的持水性反映了蛋白質與水的結合能力，能較好地反映蛋白的凝膠性，結果如圖6所示。FBPI和SBPI在pH7.0時持水性最強，分別為3.93和3.18 g/g，此時蛋白擁有較好的與水結合的能力。在pH4.0時蕎麥蛋白趨于沉淀狀態，持水性較低。當pH為10.0時，蕎麥蛋白發生部分變性，損害了蛋白本身與水的結合能力，持水性最差，FBPI和SBPI的持水性降至2.77和1.94 g/g。蕎麥分離蛋白在不同pH下的持水性為pH7.0＞pH2.0＞pH＞4.0＞pH10.0。FBPI的持水性顯著（P＜0.05）高于SBPI，表明FBPI在凝膠體系中具有更好的鎖水作用。蛋白的持水性與其蛋白本身的表面疏水性呈負相關性，本結果也與圖3中的結果一致。此外，FBPI疏松多孔的結構也在一定程度上增大了與水接觸的有效面積，有利于蛋白與水的相互作用[30]。而相反地，噴霧干燥使蛋白粉表面形成的高抗濕度薄膜卻阻礙了水分子與蛋白的接觸。鄧芝串等[26]在籽瓜種子蛋白中發現了相同的現象，即冷凍干燥處理的蛋白質樣品的持水性優于噴霧干燥，推測可能與冷凍干燥后的蛋白質的體積密度小，與水接觸時的有效面積增大有關。

圖6 蕎麥分離蛋白的持水性Fig.6 Water holding capacity of buckwheat protein isolates

2.2 TGase對蕎麥分離蛋白凝膠特性的影響

2.2.1 粒徑與電位 如圖7與表2所示，SBPI在溶液中顆粒平均直徑為192.55 nm，小于BPI（196.35 nm）。FBPI顆粒平均直徑為213.01%，略大于BPI且粒徑分布與BPI相似。PDI表示粉體粒徑大小的均勻程度，PDI越小粉體顆粒分布越均勻[31]。SBPI的PDI（0.26）顯著（P＜0.05）小于BPI（0.35）與FBPI（0.38），表明SBPI顆粒均勻程度要大于FBPI，這可能是由于蕎麥蛋白在冷凍干燥中會凍結形成大小不一的固體骨架，當水分升華后固體骨架基本保持不變，因此顆粒粒徑分布相對不均勻。李明娟等[15]對不同干燥技術處理的核桃粕蛋白粉的比表面積和跨度值進行分析，發現噴霧干燥制備的核桃粕蛋白粉體粒徑最小且大小分布均勻，與本實驗結果類似。添加TGase后，蕎麥蛋白在溶液中的平均直徑有了大幅度提升，F+TG-G組和S+TG-G組的平均粒徑分別增至2289.01與1439.67 nm，說明TGase催化蛋白質交聯形成大分子。TGase交聯的FBPI的平均直徑要遠大于S+TG-G組的平均直徑，這可能是由FBPI和SBPI自身平均直徑決定的，平均直徑大的蛋白質在TGase的催化交聯下會產生更大直徑的聚體。

圖7 蕎麥分離蛋白的粒徑Fig.7 Particle size of buckwheat protein isolates

表2 蕎麥分離蛋白凝膠溶液中蛋白質的平均直徑Table 2 Average diameter of proteins in buckwheat protein isolate gel solution

蛋白質以膠體顆粒形式分散在溶劑中，膠體顆粒之間的靜電斥力可以在一定程度上抑制蛋白膠體顆粒的聚集，是維持膠體分散性和穩定性的重要作用力。Zeta電位可以表征膠體顆粒表面的凈電荷的符號及數目，Zeta電位愈高，說明蛋白質表面所帶的電荷越多，蛋白膠體顆粒之間的靜電斥力越大，蛋白在溶劑中的穩定性越強。水相中膠體顆粒分散穩定性的分界線一般認為在+30或-30 mV[32]。如圖8所示，BPI的Zeta電位為-15.93 mV，FBPI和SBPI的Zeta電位分別為-29.43和-29.35 mV，表明冷凍干燥和噴霧干燥兩種處理均使蛋白膠體顆粒之間的靜電斥力增強，蕎麥蛋白顆粒分散體系相對穩定性較高。大量同性電荷間的相互排斥會降低蛋白分子間聚集現象發生，從而減少疏水基團被掩埋，使疏水基團更多的暴露在分子表面，導致蛋白質表面疏水性增加[33]。此結果與上文中測得的表面疏水性結果一致。干燥處理使分離蛋白在水相中的分散穩定性和表面疏水性增強，可能會對蛋白凝膠形成產生一定程度上積極的影響。加入1% TGase之后，膠體顆粒溶液的Zeta電位與干燥處理的蛋白質膠體沒有顯著性差異（P＞0.05），F+TG-G組（-28.80 mV）與S+TGG組（-29.17 mV）之間的Zeta電位沒有顯著性差異（P＞0.05），說明TGase的加入不會顯著影響溶液體系的穩定性。

圖8 蕎麥分離蛋白的Zeta電位Fig.8 Zeta potential of buckwheat protein isolates

2.2.2 動態溫度掃描 儲能模量（G'）表示物質的彈性行為，會影響凝膠的網絡結構；損耗模量（G''）表示物質的粘性行為，對凝膠網絡結構沒有影響；tanδ則代表了蛋白質網絡形成的類型，數值越小表示形成的三維凝膠網絡越好[34]。如圖9所示，蕎麥分離蛋白質溶液在25～45 ℃下tanδ＜1，體系為溶膠狀態；隨著溫度進一步增高至45～75 ℃，G'急劇下降甚至低于G''，tanδ增加。由此可以推測，當溫度加熱到45 ℃，原本聚合的蕎麥蛋白質分子內部在溫度的作用下發生重排，整個體系流動性增加，粘性行為占主導，凝膠結構被破壞。當溫度升高到75～95 ℃階段時，除BPI與F-G之外，其他3組樣品的G′均出現上升趨勢，且tanδ值逐漸減小，這可能是由于球蛋白受熱伸展，內部包埋在卷曲分子鏈內部的功能基團如疏水基團、巰基等暴露出來，蛋白質-蛋白質相互作用增強，進而形成了更為穩定的三維凝膠網絡結構。

圖9 蕎麥分離蛋白凝膠的動態溫度掃描Fig.9 Dynamic temperature scanning of buckwheat protein isolate gel

BPI和F-G在較高溫度（65～95 ℃）時G'最低，彈性行為相對較弱。這是因為一定濃度的植物天然蛋白雖然能在低溫條件下通過氫鍵、范德華力等作用形成弱凝膠，而高溫加熱會破壞鍵能較弱的氫鍵作用，從而破壞了凝膠結構[34-35]。FBPI在冷凍干燥中的低溫升華導致變性蛋白的數目較少，其凝膠行為與BPI較為相似。Vliet等[35]發現通過流變學方法研究大豆分離蛋白的熱凝膠行為時，也發現在初次加熱過程中大豆分離蛋白的儲能模量極低，這與本實驗的結果一致。Renkema等[7]以大豆分離蛋白純化得到的11S球蛋白和β-伴球蛋白為對象，研究了不同pH對大豆分離蛋白凝膠的影響，發現11S球蛋白和β-伴球蛋白的凝膠遵循Percolation模型規律，即自然條件下蛋白質在凝膠點的時候并沒有連接在一起，蛋白質在加熱過程中持續變性導致分子呈分散狀態。此外，短時高溫加熱使BPI和F-G中部分熱敏蛋白發生變性凝集，阻礙在蛋白質分子在凝膠網絡結構有序排列，也可能導致BPI和F-G的G'值降低。

添加TGase后，F+TG-G的G'呈現出上升的趨勢，體系在整個加熱過程中表現出明顯的彈性行為，而S+TG-G的G'值無顯著變化。F+TG-G組的G'較S+TG-G組出現大幅度增強，tanδ的峰值消失，表明TGase促進了冷凍干燥的蛋白質樣品內部的交聯，進而形成更穩定的三維凝膠網絡結構，抵抗了溫度對于體系凝膠化的不良影響。Zhang等[9]通過預熱-TGase處理大豆蛋白凝膠也發現了TGase添加使G'出現上升的趨勢。而S+TG-G組中SBPI蛋白分子內部的β-轉角含量較高，其大量的無規則結構影響了TGase催化的大分子之間的交聯效果，因此凝膠體系的彈性模量較低。

2.2.3 凝膠頻率掃描 分離蛋白在90 ℃加熱25 min后冷卻至25 ℃制備凝膠，其頻率掃描結果如圖10所示。在0.01～10 Hz范圍內，隨著頻率的增加，樣品的G'和G''都呈現出增加的趨勢，五個樣品的G'、G''的變化基本趨向一致，樣品的G'依次為F+TGG＞F-G＞S+TG-G＞S-G＞BPI。所有樣品的G'始終大于G''，tanδ＜1，形成以彈性行為為主導的凝膠體系，其中除F+TG-G組外的所有樣品組tanδ值隨著頻率增大而逐漸減小并趨向穩定。BPI的G'較低，可能是因為較低的表面疏水性影響了其在冷卻過程中凝膠結構的形成。此外，雖然F-G組在圖9中G'出現下降的趨勢，但在頻率掃描的結果中G'較大，表明形成了較穩定的凝膠結構，推測可能是凝膠冷卻過程中FBPI重新通過氫鍵作用形成凝膠。曹連鵬等[36]在研究酸誘導大豆蛋白凝膠形成時，也發現加熱后冷卻靜置有利于氫鍵和范德華力的形成，進而使凝膠強度進一步增強。此外，FBPI經冷凍干燥的低溫處理和瞬時升華作用使疏水基團暴露，較大的蛋白顆粒隨著頻率的增加更易發生分子重排、纏繞聚集，形成較強的凝膠結構。而噴霧干燥使處理后的分離蛋白受熱變性聚集形成較小顆粒，限制了分子鏈之間的纏繞，對凝膠結構形成產生一定的負面影響。劉麗莉等[37]研究了干燥方式對卵白蛋白和卵黏蛋白互作的影響，發現在高頻區冷凍干燥復合蛋白體系的G'大于噴霧干燥，這與本文的結果一致。加入TGase后，兩種干燥方式下的蕎麥蛋白的G'值均顯著提升，F+TG-G組凝膠G'大于S+TG-G。TGase的加入會使體系產生分子內或分子間的酰基共價交聯，進一步促進了分離蛋白分子之間糾結纏繞，表現出更強的彈性行為。Nonaka等[10]在研究TGase對大豆蛋白熱誘導凝膠改良作用時，發現0.5%及1% TGase能夠顯著提高蛋白凝膠網絡的凝膠強度。F+TG-G組的tanδ值隨頻率增大變化不明顯，且整個過程均在0.3以下，表明該樣品體系均是以彈性行為為主導的穩定凝膠網絡結構，且凝膠穩定性最強。

圖10 蕎麥分離蛋白凝膠的頻率掃描Fig.10 Sweep frequency of buckwheat protein isolate gel

2.2.4 凝膠的分子間作用力分析 植物球狀蛋白在熱凝膠時，首先在常溫下充分溶脹形成溶膠，此時蛋白質分子結構呈現緊密的卷曲狀態；當溫度達到蛋白的變性溫度時，蛋白質發生變性使體系的粘度上升，分子結構開始伸展；當溫度繼續增加時，蛋白質結構充分展開，功能基團暴露，并在隨后的冷卻過程中蛋白分子間通過二硫鍵和氫鍵、靜電引力、疏水相互作用及范德華力等非共價鍵相互作用，形成三維網絡結構并將水分包裹在內形成凝膠[6,38]。

如圖11所示，蕎麥分離蛋白凝膠的重要作用力為疏水相互作用和二硫鍵。FBPI的氫鍵和疏水相互作用較大，但分子間離子鍵和二硫鍵小于SBPI。蛋白質在噴霧干燥熱處理過程中會吸收能量導致氫鍵斷裂，此時三級結構受到破壞形成無序狀態，β-轉角的含量會相應升高[39]。SBPI的共價二硫鍵強于FBPI，可能是由于噴霧干燥過程中高溫處理促進了二硫鍵的形成。田少君等[39]研究了不同干燥方式對星油藤分離蛋白結構的影響，發現與冷凍干燥相比，噴霧干燥更大程度地促進了巰基的暴露和二硫鍵的形成。

圖11 蕎麥分離蛋白凝膠的分子間作用力Fig.11 Intermolecular forces of buckwheat protein isolate gels

加入TGase后，分離蛋白凝膠中氫鍵被破壞，離子鍵、疏水相互作用及二硫鍵增強。氫鍵含量的下降可能與TGase催化了原本可以提供氫鍵的谷氨酰胺和賴氨酸殘基形成了共價交聯有關。此外，TGase催化產生分子間共價交聯也會造成蕎麥蛋白分子的高結合能和空間位阻效應，進而破壞了一部分蛋白質分子間及蛋白質與水分子間的氫鍵，可能也會導致分離蛋白凝膠分子間氫鍵含量的下降[40]。凝膠體系的離子鍵增強是由于一定濃度的TGase還能催化谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基團脫胺轉變為谷氨酸殘基，進而使體系中的離子強度升高，分子間的離子鍵作用增強[41]。王瑩[42]也發現當TGase的添加量較高時，核桃蛋白凝膠分子間的離子鍵出現增加的趨勢。TGase添加下疏水作用的增強可能是由于TGase催化產生的蛋白質分子內和分子間的共價交聯，使蛋白質的空間結構發生改變，原本折疊在內部的疏水位點暴露，進而形成更多的疏水作用，同時蛋白質折疊的效應使部分游離巰基在空間上更接近，也更利于二硫鍵的形成[43]。

S+TG-G組的二硫鍵顯著（P＜0.05）高于F+TGG組（圖11），但儲能模量更低，表明雖然化學鍵測定中顯示添加TGase的蕎麥蛋白凝膠形成的主要作用力是二硫鍵、疏水作用，但共價二硫鍵與凝膠的強弱無直接關聯。Gosal等[38]研究球狀蛋白凝膠結構時發現疏水作用是穩定熱誘導凝膠的關鍵作用力。Koseki等[44]在研究鹽對卵清蛋白熱變性物化性質影響時，發現二硫鍵不能當作起始凝膠網絡的骨架，但可以在一定程度上維持凝膠網絡結構，提高凝膠穩定性。此外，TGase催化蕎麥蛋白分子間的共價交聯對凝膠網絡的形成也起到關鍵作用。秦新生[43]研究了超高壓對TGase促大豆與小麥蛋白凝膠的分子間作用力的影響，發現TGase形成的凝膠三維網絡中主要的作用力是ε-（γ-谷氨酰胺）賴氨酸共價鍵，且疏水相互作用在TGase誘導的混合蛋白凝膠形成中起著重要作用，這與本實驗的結果一致。

3 結論

本實驗圍繞不同干燥方式對蕎麥蛋白的理化性質展開研究，同時探討了TGase對兩種蕎麥蛋白凝膠特性的影響。對干燥處理及未經干燥處理的蕎麥蛋白理化性質進行比較，發現噴霧干燥蕎麥分離蛋白的具有更高的表面疏水性和更均勻的粒徑；冷凍干燥制備得到的蕎麥蛋白相較于噴霧干燥其溶解性和持水性更好，蛋白平均粒徑與分布與未經干燥處理蕎麥蛋白無顯著差異。加入TGase后，冷凍干燥蕎麥分離蛋白和噴霧干燥蕎麥分離蛋白的平均粒徑分別由213.01與192.55 nm增加至2289.01與1439.67 nm，表明發生了蛋白分子間的交聯反應。

冷凍干燥分離蛋白凝膠經加熱冷卻后的儲能模量更高，但在加熱過程中容易受到溫度的影響。TGase的加入能顯著（P＜0.05）促進冷凍干燥蕎麥蛋白分子間疏水作用與二硫鍵的形成，進而有效增強了凝膠性與凝膠網絡的穩定性。相比之下，噴霧干燥蕎麥蛋白即使在TGase作用下依舊未能得到較好的凝膠，這與噴霧干燥過程蛋白發生的熱變性有關。本研究的結果也表明疏水相互作用、二硫鍵以及TGase催化的共價交聯是蕎麥分離蛋白凝膠形成的主要化學作用力，其中二硫鍵與凝膠的強弱無直接關聯，但可以在一定程度上起到穩定凝膠體系的作用。

本研究結果可為蕎麥分離蛋白工業制備及其作為蛋白配料在食品（肉糜、飲料、面制品等）中的應用提供一定理論參考。