梅奇酵母氨基甲酸乙酯酶分離純化與酶學性質分析及其對葡萄酒香氣的影響

孟凡徳，史學偉

（1.新疆兵團第五師科技局，新疆博樂 833400；2.石河子大學食品學院，新疆石河子 832000）

梅奇酵母（Metschnikowia）是一種廣泛存在葡萄 表皮的野生酵母，主要作用于葡萄酒發酵前期[1]，可增加葡萄酒香氣等風味物質，有效抑制葡萄酒“變質”[2]。氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是一種多位點2A級[3]致癌物。早在50多年前，Lofroth等首次在啤酒中檢測到氨基甲酸乙酯[4]，而后許多研究中，在白蘭地、葡萄酒[5]和中國黃酒等酒精飲料[6]均有發現。參與EC合成的前體物質主要是氨甲酰基團，如尿素、瓜氨酸和氨甲酰磷酸[7]等。EC代謝途徑一般分為三種，分別是：尿素與乙醇、瓜氨酸及氰化物途徑，其中尿素與乙醇的反應是最為常見的氨基甲酸乙酯生成途徑[8]。除此以外，酵母菌通過氮代謝分解精氨酸可以間接控制EC形成[9]。

通過添加酸性脲酶來[10-11]控制EC前體物質的形成、調控EC形成條件和水解法降低EC含量可以控制酒類飲料中EC形成。相對于梅奇酵母的研究大都集中于在釀造過程與釀酒酵母（Saccharomyces uvarum）混菌發酵生產低醇葡萄酒[12-13]，部分學者篩選一株可以降解EC的釀酒酵母[14]，同時對篩選可降解EC的菌株優化了其產酶條件[15-17]。除此以外，對于降低酒精飲料中EC研究報道也層出不窮。程艷等[18]利用高通量誘變降低EC前體物質從而降低其含量，吳殿輝[19]對黃酒專用的釀酒酵母的基因組進行改造降低EC含量。通過微生物酶解降低葡萄酒中EC含量的方法是一種安全、有效、綠色的方法，但是由于不同酒體的環境條件不同，具有降解EC能力的菌株呈現出較低的發酵性能，難以在葡萄酒的釀造中使用，并且分離純化釀酒酵母后所產的EC降解酶在高乙醇、低酸條件下，酶的活性往往會受到明顯地抑制。綜上所述，篩選EC降解菌及分離純化高耐酸性、高乙醇耐受性的EC降解酶在目前來說具有重要的意義。

頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術（Headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）在環境檢測[20]、醫學檢驗[21]和農畜產品質量檢測[22]、測定葡萄酒中揮發性香氣成分含量測定[23]時作為首選檢測技術。本研究以前期實驗室報道出的一株具有較好的EC降解能力[24]的魯考弗梅奇酵母菌（Metschnikowia reukaufii）為研究對象，采用硫酸銨鹽析、離子交換層析方法對該酵母菌所產的EC酶進行分離純化，并進一步研究該降解酶的酶學性質，為該菌株產EC的工業化生產及EC酶在后期處理葡萄酒中EC的使用提供理論借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

供試葡萄酒 新疆張裕巴堡男爵酒莊（MR）和新疆西域明珠酒莊（SR）；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、牛血清蛋白 天津盛奧化學試劑有限公司；NaCl、KH2SO4、Na2SO4、CH3OH、NaOH、HCl、檸檬酸、檸檬酸鈉、（NH4）2SO4、Na2HPO4奧博星生物技術公司；CH3CH2OH（99%）、乙醚（90%）、丙酮

天津市富宇精細化工有限公司；氨基甲酸乙酯、D5-氨基甲酸乙酯（99.9%） Sigma公司；上述試劑除特別標明以外，均為分析純；3-辛醇（99%） 北京索萊寶科技有限公司；正構烷烴混標（C7～C33） 廣州威佳科技有限公司。

722光柵分光光度計 上海精若科學儀器有限公司；VCX500超聲細胞破碎儀 Sonics & Materials. Ins；PS2001瓊脂糖凝膠電泳儀、Gel DC XR凝膠成像系統 北京六一生物科技有限公司；FRESCO 21低溫高速離心機 Thermo Fisher Scientific；Agilent7890B GC與Agilent5977 MS檢測器、HP-5 Innowax毛細管柱 安捷倫分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液制備 參考劉曉慧[25]的方法。吸取1 mLMetschnikowia reukaufii菌種保藏液于50 mL活化培養基（蛋白胨1.0 g/L、葡萄糖2.0 g/L、酵母浸粉2.0 g/L，氨基甲酸乙酯5.0 g/L）中，28 ℃恒溫連續培養24 h。以1%的接種量接種到發酵培養基[26]（麥芽糖15.0 g/L，NH4Cl 5.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氨基甲酸乙酯7.5 g/L）中，以相同條件培養。以2%的接種量將處于對數生長期的種子液接種到新鮮的發酵培養基中，28 ℃、170 r/min連續振蕩培養48 h，以制得發酵液。

發酵液在低溫條件下，6000 r/min離心10 min棄上清液收集菌體。用0.05 mol/L、pH3.0～7.0檸檬酸緩沖液沖洗菌體，離心收集菌體，重復操作2次后得到菌體，再次以適量體積檸檬酸緩沖液洗滌菌體于冰浴中超聲破碎細胞30 min，4 ℃、8000 r/min離心10 min，此時上清液即為粗酶液。

1.2.2 EC酶的分離純化 采用楊廣明[27]和張美珍等[28]的方法并做了部分改進。取50 mL粗酶液，向其中緩慢分別加入60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%（NH4）2SO4，充分混勻，4 ℃靜置過夜沉淀。4 ℃、8000 r/min離心5 min，得到沉淀后加少量蒸餾水復溶，透析袋透析48 h，每8 h換一次水直至完全去除（NH4）2SO4。使用Hitrap DEAE FF預裝柱進行離子交換層析，0.2 mol/L、pH7.9的PBS緩沖液進行平衡，加入1 mol/L NaCl于PBS緩沖液進行梯度洗脫。

洗脫液使用超濾管進行快速濃縮，之后使用凝膠層析法進行最終酶的純化，該步驟使用Superdex 200凝膠柱。對純化后的EC酶進行酶活的測定。

1.2.3 粗酶酶活及蛋白含量的測定 對1.2.1中粗酶液中粗酶及分離純化后EC酶的酶活進行測定。酶活測定參照周雪燕等[16]的方法，采用Berthelot比色法。其中將常溫常壓下1 min分解相應底物產生1 μmol氨的酶量為1個酶的活力單位稱之為酶活[17]。

對粗酶液中粗酶的蛋白質含量測定參照Bradford[29]和丁霞等[30]方法，使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒對蛋白含量進行測定。

1.2.4 EC酶酶學性質測定 最適反應溫度及熱穩定性：將純化后的降解酶分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃的不同溫度下進行反應時測定酶活，測定酶的最適反應溫度。將降解酶置于上述溫度區間下恒溫30 min，將其轉移到最適溫度下進行酶活的測定，確定EC酶的熱穩定性。

最適pH及pH穩定性：在最適溫度下，將酶置于3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的不同pH條件下進行反應時測定酶活，得到降解酶的最適pH。將降解酶置于上述pH梯度下，以最適溫度恒溫30 min后測定酶活，研究降解酶的pH穩定性。

乙醇耐受性試驗：在最適pH條件下配制1%、3%、5%、7%、9%、12%、15%、18%的不同濃度的乙醇溶液，添加3% EC作為底物和3%的EC酶，測定反應時的酶活。

1.2.5 EC酶對不同底物降解能力研究 參考谷曉蕾等[31]方法，在最適溫度和最適pH的條件下，在0.05 mol/L、pH3.0～7.0的檸檬酸緩沖液分別添加3%的氨基甲酸乙酯、尿素、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和瓜氨酸為底物，加入3% EC酶。取1 mL于比色管，50 ℃水浴反應30 min, 測定OD625值。

1.2.6 EC酶對揮發性香氣物質影響研究 將提取純化后的EC酶以3%的接種量接種至市售干紅葡萄酒中進行反應，24 h后測定相關成分。添加了EC酶的葡萄酒為實驗組，未添加的市售干紅葡萄酒酒樣為對照組。

參考孫娜等[32]作改性方法，采用HS-SPMEGC-MS法測定市售干紅葡萄酒中揮發性香氣成分，并對其進行定性定量分析。稱取1 g NaCl和5 mL加入酒樣于10 mL頂空瓶中，同時加入2 μL 1 μg/L 3-辛醇標準溶液。樣品在45 ℃平衡20 min，恒溫以500 r/min持續60 min，萃取結束解吸5 min。使用Agilent7890B GC與Agilent5977 MS檢測器與HP-5 Innowax毛細管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）進行檢測。進樣口溫度設定為230 ℃，氦氣作為載氣，流速設定為1.0 mL/min。將GC爐溫度保持在40～180 ℃，3 mL/min，5 min時上升到230 ℃。在離子源溫度270 ℃、電子能源70 eV時，獲得電子沖擊質譜，總離子色譜儀（TICs）掃描范圍為35～500 m/z，速率5次/s。

定性分析：根據化合物保留指數RI（Retention Index，RI）（≥800）及NIST14譜庫檢索處理初步確定揮發性成分名稱。其中，通過正構烷烴（C7～C33）混標物的保留時間來計算未知化合物的RI值，保留指數根據改進的Kovats法計算得到[33]。

定量分析：以3-辛醇為內標物，采用內標法進行半定量分析，揮發性成分的質量濃度根據公式（1）計算[34]。

式中：X：香氣物質質量濃度，μg/L；A：所測峰面積；A0：內標物峰面積；C：內標物質量濃度，μg/L。

1.3 數據處理

本實驗所得數據以平均值±標準偏差顯示，采用Smica 14.1和Origin 2018軟件進行繪圖分析，R語言用做聚類分析。

2 結果與分析

2.1 純化前后EC酶酶活及蛋白含量變化

采用Berthelot比色法對分離到含有EC酶的粗酶液進行酶活測定，分別比較了純化前后的酶活及蛋白含量的變化（圖1）。純化前酶活0.16 U/mL，純化后酶活提高至0.35 U/mL；與之相反，純化前蛋白含量4.43 mg/L，純化后蛋白含量降低至2.62 mg/L。結果表明，經過純化后的EC酶酶活提高了約1.2倍，而蛋白含量大約降低了0.4倍，這主要是因為葡萄酒中的酶大多數屬于是蛋白質，在純化除去其他酶后，酶含量有所降低。

圖1 純化前后EC酶的相對酶活（A）和蛋白含量（B）的變化Fig.1 Changes of the relative enzyme activity (A) and protein content (B) of EC enzymes before and after purification

2.2 EC酶酶學性質分析

2.2.1 EC酶的最適溫度及熱穩定分析 通過測定EC酶的最適溫度及熱穩定性，結果表明，EC酶的酶活性和穩定性受不同溫度的影響較大（圖2）。Metschnikowia reukaufii菌株所產EC酶最適作用溫度為35 ℃，在該溫度下酶活達到了0.52 U/mL，并且在25～45 ℃范圍內，EC酶酶活高于0.28 U/mL，且熱穩定性較強，這同之前所報道的結果相一致[35]。當溫度持續30 min后在35 ℃時EC酶酶活達到0.51 U/mL，酶活降低速率極低，幾乎可以忽略不計。結果表明，EC酶最適作用溫度為35 ℃，熱穩定性強。在后期使用中可將EC酶加入成品葡萄酒中置于35 ℃時，該酶可發揮的降解作用最大。

圖2 酶作用的最適溫度（A）和熱穩定性（B）Fig.2 Optimum temperature (A) and thermal stability (B) of enzyme action

2.2.2 EC酶的最適pH及pH穩定性分析 在釀酒過程中控制其初始pH可降低EC含量[36]，通過對比EC酶的最適pH及pH穩定性發現（圖3）：當pH處于5～6之間時，EC酶的酶活能夠保持在0.30 U/mL以上。當pH為5.5時酶活最高，高達0.52 U/mL；當pH大于7.0時，酶的活性受抑制作用比較明顯，酶活接近于0，失去活性。與此同時，當EC酶在pH5.5條件下維持30 min后酶活雖降低到0.49 U/mL，但酶活降低速率依舊低于其他pH條件；結果表明，EC酶最適pH為5.5，且該酶在pH5～6之間時穩定性較強，這也說明該酶酸穩定性強，堿穩定性較差。因此，該酶在弱酸性酒精飲料中能更好地發揮作用，例如干紅葡萄酒。

圖3 酶作用的最適pH（A）和pH穩定性（B）Fig.3 Optimal pH (A) and pH stability (B) of enzyme action

2.2.3 EC酶的乙醇耐受性分析 隨著乙醇體積分數逐漸增加，EC酶的酶活呈現下降趨勢。當乙醇體積分數范圍為12%～14%，EC酶的酶活降低到0.12 U/mL（圖4），這可能是由于高濃度乙醇可能導致酶結構發生變化，進而導致活性的降低。文獻表明，當葡萄酒中乙醇分數為12%～14%時，使用EC酶可將EC含量降解至質量濃度≤20 μg/L[37]。結果表明，當乙醇體積分數范圍為12%～14%，EC酶具有一定活性。

圖4 乙醇對酶活的影響Fig.4 Effect of ethanol on enzyme activity

2.3 EC酶的降解底物特異性分析

為了解EC酶對底物的特異性，添加EC、尿素、谷氨酸、谷氨酰胺等不同底物，底物特異性研究結果如圖5所示。EC酶對EC、尿素具有較高的降解效率，降解率分別為77.50%、82.40%，并且對合成EC相關的一些其他前體物質（精氨酸和瓜氨酸）具有一定的降解能力，而對谷氨酸和谷氨酰胺卻沒有降解能力。表明該EC酶具有較強的底物專一性，且具有效清除EC及其前體物質的能力。

圖5 EC酶對不同底物降解率Fig.5 Degradation rates of different substrates by EC enzymes

2.4 不同處理的干紅葡萄酒揮發性香氣成分比較分析

通過不同處理方法比較EC酶對葡萄酒揮發性性風味物質的影響，結果如圖6A所示。通過主成分分析得到該圖解釋了原變量總方差79.9%，主成分1解釋原始變量總方差71.2%，剩余8.7%由主成分2解釋。結果表明兩款葡萄酒的揮發性化合物具有一定的差異性，但是對同一種葡萄酒進行接種純化后EC酶處理后，相較于MR酒樣SR酒樣香氣成分更具有一定的相似性。

圖6 兩款葡萄酒不同處理后揮發性化合物的主成分分析（A）及熱圖（B）Fig.6 Principal component analysis (A) and heat map (B) of volatile compounds in two wines with different treatments

通過揮發性化合物的聚類熱圖（圖6B）可以看出，兩種葡萄酒揮發性化合物的種類差別不大，但是含量差異明顯。SR酒樣在加入EC酶前后月桂酸乙酯、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸、乳酸乙酯、己酸乙酯、環丁醇、月桂酸含量均較高，無明顯變化，且在加入EC酶處理后酒樣中己酸乙酯含量增加；MR酒樣在加入EC酶純化后苯甲醇、正己酸、乳酸丙酯、異丁酸、癸酸異戊酯等含量較高，無明顯變化，在加入EC酶純化后十七烷-9-醇和（R）-（+）-β-香茅醇含量增加。結果表明：兩款酒經過處理以后，各自的揮發性化合物組成及含量基本沒有變化，這說明EC酶對于葡萄酒的揮發性香氣物質幾乎沒有影響。

3 結論

本研究通過對實驗室前期分離得到的一株魯考弗梅奇酵母（Metschnikowia reukaufii）所產的EC酶進行分離純化后，分析了EC酶的酶學性質，發現分離純化后的EC酶的酶液蛋白含量雖減少，但其酶活提高了約1.2倍。EC酶酶學性質分析結果表明，EC酶的最適作用溫度為35 ℃，最適作用pH為5.5，且該酶在pH為5～6時酶活穩定性強。通過對降解底物的特異性研究發現，該酶對EC和尿素的降解能力較為突出，底物專一性強，具有清除EC及其前體物質的能力。將此EC酶加入葡萄酒前后揮發性風味物質并無明顯變化。綜上所述，魯考弗梅奇酵母所產EC酶具有一定活性和耐受性且不改變葡萄酒揮發性香氣物質，為該菌株產EC的工業化生產及EC酶在后期處理葡萄酒中EC的使用提供理論借鑒，但對于EC酶降解EC的機理有待于進一步研究。