離子色譜-脈沖安培法同時(shí)測(cè)定蔗糖酶和果聚糖酶活力的方法建立

劉忠瑩，王小平，陸 陽，何葉馨，王 鑫，黃韜睿

（1.四川省食品檢驗(yàn)研究院，四川成都 610097；2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（白酒監(jiān)管技術(shù)），四川成都 610097；3.四川旅游學(xué)院，四川成都 610100）

蔗糖酶（Sucrase，EC 3.2.1.26）又稱轉(zhuǎn)化酶，可以從果糖末端切開蔗糖的果糖糖苷鍵，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖[1-2]。果聚糖酶（Inulinase，EC 3.2.1.80）又稱菊粉酶，能夠水解β-2，1-D-果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶，能使菊粉水解生成葡萄糖和果糖[3-5]。蔗糖酶與果聚糖酶的應(yīng)用與生活密切相關(guān)，蔗糖酶廣泛應(yīng)用于食品和發(fā)酵工業(yè)[6]，果聚糖酶廣泛用于生產(chǎn)高果糖漿[7-8]、生產(chǎn)酒精[9]、甚至可生產(chǎn)生物柴油的原料[10]、醫(yī)藥產(chǎn)氫、制備乳酸。菊粉酶還可直接發(fā)酵菊粉制備各種產(chǎn)品，如可制備丙酮丁醇，用于診斷腎臟疾病，控制血糖升高[11]等。此外，在兩種酶應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)存在同時(shí)使用的情況，如果聚糖含量測(cè)定[11]、應(yīng)用菊粉生產(chǎn)酒精等領(lǐng)域，如能同時(shí)測(cè)定這兩種酶活力將大大節(jié)約分析時(shí)間。

酶活力的測(cè)定方法對(duì)確定酶活力的水平、酶特異性及歸類有著重要意義。目前關(guān)于蔗糖酶活力測(cè)定國(guó)內(nèi)外采用的方法集中于3,5-二硝基水楊酸比色法（DNS法），如韓蕓嬌等[12]采用DNS法測(cè)定出面包酵母凍干粉中蔗糖酶活力；李勤[13]采用DNS法測(cè)定出海藻酸鈉包埋法固定啤酒酵母泥前后蔗糖酶活力；Liu等[14]調(diào)查15個(gè)不同樣地蔗糖酶隨季節(jié)變化的酶活性，也是用了DNS法。果聚糖酶活力測(cè)定方法主要是包括DNS法[15-16]、費(fèi)林試劑熱滴定法、塞氏比色法、Somogi-Nelson法[17-18]等，以上測(cè)定蔗糖酶活力、果聚糖酶活力方法雖然對(duì)儀器設(shè)備要求低，檢測(cè)成本低，實(shí)用性好，但這些方法都會(huì)涉及有毒有害試劑的使用，比如DNS法[19-20]、Somogi-Nelson法中會(huì)用到高毒性的苯酚，滴定法中會(huì)用到易制毒試劑硫酸，塞氏比色法中會(huì)用到3類致癌物的間苯二酚等不利于實(shí)驗(yàn)人員身體健康和環(huán)境保護(hù)的試劑，而目前檢測(cè)方法單一，還沒有出現(xiàn)創(chuàng)新新穎環(huán)境友好的酶活力測(cè)定方法。

本文采用蔗糖為底物，加入蔗糖酶后用硼氫化鈉將其水解產(chǎn)物葡萄糖和果糖還原成甘露醇和山梨醇，并將蔗糖酶高溫失活后加入果聚糖酶，再次得到水解產(chǎn)物葡萄糖和果糖；最后采用離子色譜-脈沖安培法測(cè)定甘露醇和山梨醇的總量來計(jì)算蔗糖酶的活力，測(cè)定葡萄糖和果糖的總量來計(jì)算果聚糖酶的活力，建立一種全新的環(huán)境友好的能同時(shí)測(cè)定蔗糖酶、果聚糖酶活力的方法,為酶活力的測(cè)定提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔗糖、山梨醇 BePure公司；菊粉 阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；蔗糖酶、果聚糖酶、葡萄糖、果糖德國(guó)Sigma公司；甘露醇 美國(guó)A Chemtek Inc 公司；50%氫氧化鈉溶液（色譜純） 賽默飛科技（中國(guó)）有限公司；乙酸鈉氫氧化鈉（色譜純） 美國(guó)ThermoFisher公司；馬來酸、硼氫化鈉、冰乙酸 均為分析純。

Dionex? ICS-5000+離子色譜儀（配有電化學(xué)檢測(cè)器）、Evolution201紫外-分光光度計(jì)、色譜柱CarboPaCTMPA20 250 mm×2 mm和CarboPaCTMPA1 250 mm×2 mm 美國(guó)ThermoFisher公司；SW22 恒溫水浴鍋 丹麥FOSS公司；MS3漩渦振蕩儀 德國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本文部分色譜條件，蔗糖酶溶液、果聚糖酶溶液配制，加入硼氫化鈉步驟可參考GB 5009.255-2016[11]。

1.2.1 單糖檢測(cè)色譜條件及標(biāo)曲繪制

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱：CarboPaCTMPA1 250 mm×2 mm，淋洗液：A：水；B：氫氧化鈉溶液（100 mmol/L）；C：氫氧化鈉（150 mmol/L）乙酸鈉（500 mmol/L）混合溶液，梯度洗脫條件見表1，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波形參見表2。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用4個(gè)容量瓶分別準(zhǔn)確稱取10 mg山梨醇、10 mg甘露醇、10 mg葡萄糖和10 mg果糖，用水稀釋定容至刻度，得1000 μg/mL山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Program of gradient elution

表2 檢測(cè)波形Table 2 Detection waves

1.2.1.2 標(biāo)曲繪制 分別精密移取山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL至同一20 mL量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，制成山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖濃度均為20 μg/mL的混合儲(chǔ)備液。分別精密移取該儲(chǔ)備液0.04、0.1、0.2、0.4、0.5、1 mL至10 mL量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，即山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖濃度均為0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 μg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入離子色譜儀中，得到各濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 水解底物篩選

1.2.2.1 蔗糖與菊粉的純度考察 蔗糖溶液：準(zhǔn)確移取1.0 mol/L蔗糖溶液（pH6.5的馬來酸鈉緩沖液為溶劑）0.8 mL于10 mL刻度試管中，以去離子水稀釋至刻度，搖勻，試液稀釋50倍后待測(cè)。菊粉溶液：準(zhǔn)確移取1.0 mol/L菊粉溶液（pH6.5的馬來酸鈉緩沖液為溶劑）0.8 mL于10 mL刻度試管中，以去離子水稀釋至刻度，搖勻，試液稀釋50倍后待測(cè)。

1.2.2.2 果聚糖酶酶解蔗糖考察 準(zhǔn)確移取1.0 mol/L蔗糖溶液0.8 mL于10 mL刻度試管中，準(zhǔn)確加入果聚糖酶（用pH4.5的乙酸鈉緩沖液稀釋至1～10 U/mL，下同）0.1 mL，（55±1）℃恒溫水浴保溫30 min，立即沸水浴中加熱3 min，以終止酶促反應(yīng)。用水稀釋至刻度，混勻。試液稀釋50倍后待測(cè)。

1.2.3 糖醇轉(zhuǎn)化條件考察 在含有0.5 mg葡萄糖和0.5 mg果糖的混合溶液中加入一定量的10 mg/mL硼氫化鈉溶液（100、200、300、400、500 μL），旋渦振蕩混勻，置于一定溫度下（20、30、40、60 ℃）的恒溫水浴搖床中，150 r/min振搖一定時(shí)間（5、10、30、60 min）后，取出，冷卻至室溫，加入3 mL 200 mmol/L乙酸溶液，靜置10 min后搖勻，待測(cè)。當(dāng)考察還原劑使用量時(shí)，固定還原溫度為40 ℃，還原時(shí)間為30 min；當(dāng)考察還原時(shí)間時(shí)，固定還原劑使用量為300 μL、還原溫度為40 ℃；當(dāng)考察還原溫度時(shí)，固定還原劑使用量為300 μL，還原為30 min。

1.2.4 離子色譜法測(cè)定蔗糖酶和果聚糖酶活力

1.2.4.1 酶解溶液制備 蔗糖酶的酶解：準(zhǔn)確移取1.0 mol/L蔗糖溶液0.8 mL于10 mL刻度試管中，準(zhǔn)確加入蔗糖酶（用pH6.5的馬來酸鈉緩沖液稀釋至約4.5 U/mL，下同）0.1 mL，在（37±1）℃恒溫水浴中保溫30 min后，立即沸水浴中加熱3 min，以終止酶促反應(yīng)。

葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)化：取出冷卻至室溫后的蔗糖酶酶解溶液加入1.2 mL硼氫化鈉溶液（10 mg/mL，下同），旋渦振蕩混勻，置于（60±1）℃恒溫水浴搖床中，150 r/min振搖30 min后，取出，冷卻至室溫，加入3 mL 200 mmol/L乙酸溶液，靜置10 min后加1 mol/L入氫氧化鈉溶液0.25 mL，搖勻。

果聚糖酶的酶解：繼續(xù)在上述溶液中準(zhǔn)確加入果聚糖酶0.1 mL，（55±1）℃恒溫水浴保溫30 min，立即沸水浴中加熱3 min，以終止酶促反應(yīng)。用水稀釋至刻度，混勻。試液稀釋50倍后待測(cè)。

1.2.4.2 試樣溶液的測(cè)定 將試樣溶液注入離子色譜儀中，得到試樣溶液的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖的濃度（μg/mL），通過酶活力計(jì)算公式得蔗糖酶和果聚糖酶活力。蔗糖酶活力表示為：在37 ℃、pH6.5條件下，以蔗糖為底物每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol還原糖相應(yīng)的醇（山梨醇和甘露醇）所需的酶量（活性）定義為1個(gè)酶活力單位。果聚糖酶活力表示為：在55 ℃、pH4.5條件下，以蔗糖為底物每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol還原糖（葡萄糖和果糖）所需的酶量（活性）定義為1個(gè)酶活力單位。

蔗糖酶活力計(jì)算：根據(jù)步驟所得山梨醇濃度、甘露醇濃度，用下述公式計(jì)算，得到蔗糖酶活力，蔗糖酶活力計(jì)算公式：

式中：X1，蔗糖酶活力，U/mL；C1，試樣中山梨醇的濃度，μg/mL；C2，試樣中甘露醇的濃度，μg/mL；V，試樣的最終定容體積，mL；M1，山梨醇的摩爾質(zhì)量，182 g/mol；M2，甘露醇的摩爾質(zhì)量，182 g/mol；Vx1，制備試樣時(shí)蔗糖酶溶液取用體積，mL；t1，制備試樣時(shí)蔗糖酶酶解蔗糖的時(shí)間，min。

果聚糖酶活力計(jì)算：根據(jù)所得葡萄糖濃度、果糖濃度，用下述公式計(jì)算，得到果聚糖酶活力，果聚糖酶活力計(jì)算公式：

式中：X2，果聚糖酶活力，U/mL；C3，試樣中葡萄糖的濃度，μg/mL；C4，試樣中果糖的濃度，μg/mL；V，試樣的最終定容體積，mL；M3，葡萄糖的摩爾質(zhì)量，180 g/mol；M4，果糖的摩爾質(zhì)量，180 g/mol；Vx2，制備試樣時(shí)果聚糖酶溶液取用體積，mL；t2，制備試樣時(shí)果聚糖酶酶解蔗糖的時(shí)間，min。

1.2.5 DNS法測(cè)定蔗糖酶和果聚糖酶活力 為了驗(yàn)證本試驗(yàn)測(cè)定蔗糖酶和果聚糖酶活力的可靠性，將本方法測(cè)定的結(jié)果與DNS法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較，DNS方法參考GB 5009.255-2016中蔗糖酶和果聚糖酶活力的測(cè)定方法。過程如下：

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：在葡萄糖系列濃度的比色管中分別加入0.5 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，混勻后于沸水浴中加熱10 min。取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，用水定容至10 mL，混勻，以未加入葡萄糖的比色管為空白，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)540 nm處的吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.1 蔗糖酶活性測(cè)定 準(zhǔn)確移取1.0 mol/L蔗糖溶液0.8 mL于10 mL刻度試管中，準(zhǔn)確加入蔗糖酶0.1 mL，在（37±1）℃恒溫水浴保溫30 min后，沸水浴中加熱3 min，以終止酶促反應(yīng)，取出，冷卻至室溫后，再向該溶液中加入0.5 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液后同1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作，混勻后稀釋5倍測(cè)定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)酶測(cè)定液中和試劑空白測(cè)定液中葡萄糖的質(zhì)量濃度。在相同的條件下，以沸水浴鈍化酶液作為試劑空白。根據(jù)1.2.4.2蔗糖酶活力計(jì)算公式計(jì)算蔗糖酶活力。

1.2.5.2 果聚糖酶活性測(cè)定 準(zhǔn)確移取1.0 mol/L蔗糖溶液0.8 mL于10 mL刻度試管中，準(zhǔn)確加入果聚糖酶0.1 mL，在（55±1）℃恒溫水浴保溫30 min后，沸水浴中加熱3 min，以終止酶促反應(yīng)，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，加入0.5 mL，3,5-二硝基水楊酸溶液后同1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作，混勻后稀釋5倍測(cè)定。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)酶測(cè)定液中和試劑空白測(cè)定液中葡萄糖的質(zhì)量濃度。在相同的條件下，以沸水浴鈍化酶液作為試劑空白。根據(jù)1.2.4.2果聚糖酶活力計(jì)算公式計(jì)算果聚糖酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文采用Chromeleon Client Program（6.80）色譜工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，結(jié)果重復(fù)性平行測(cè)定5次，采用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，計(jì)算后的結(jié)果利用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本試驗(yàn)方法與DNS方法測(cè)定的酶活力結(jié)果進(jìn)行方差分析，置信區(qū)間百分比為95%，色譜圖為直接截取色譜工作處理的的圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

目前關(guān)于應(yīng)用離子色譜測(cè)定糖醇的文獻(xiàn)報(bào)道很多，de Souza等[21]建立了一種同時(shí)檢測(cè)葡萄酒樣品中的糖、有機(jī)酸和糖醇的方法，彭麗詩(shī)等[22]建立了一種離子色譜-脈沖安培法同時(shí)測(cè)定食品中9種糖和糖醇的方法，張水鋒等[23]也建立了一種離子色譜-脈沖安培法分析嬰幼兒配方乳粉中的糖和糖醇的方法。本試驗(yàn)色譜條件為CarboPaCTMPA1 250 mm×2 mm，40% 100 mmol/L氫氧化鈉。在該色譜條件下，山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖能夠很好地分離，且色譜峰型也好，4種化合物的線性相關(guān)性良好，能夠滿足分析要求，具體結(jié)果見表3和圖1。

圖1 四種化合物色譜分離圖Fig.1 Chromatograms of mannitol, sorbitol, glucose and fructose

表3 山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖四種化合物的線性及范圍Table 3 Linearity and range of annitol, sorbitol,glucose and fructose

2.2 水解底物的篩選

通常，蔗糖酶活力測(cè)定采用的底物為蔗糖，果聚糖酶活力測(cè)定采用的底物為菊粉，但菊粉很容易水解且高純度的菊粉很難獲得[24-25]。圖2為一定量的蔗糖和菊粉分別進(jìn)樣得到的色譜圖，可見蔗糖色譜峰中不含葡萄糖和果糖，而菊粉中含有一定量的葡萄糖和蔗糖，即采用此菊粉為底物測(cè)得的果聚糖酶活力將偏高。林晨[18]、常曉川[26]、王東方[27]等多篇文獻(xiàn)都報(bào)道過果聚糖酶可酶解蔗糖。圖3是采用蔗糖為底物，經(jīng)果聚糖酶水解后的圖譜，可見圖譜中出現(xiàn)了蔗糖和果糖的峰，即證明了果聚糖酶能夠水解蔗糖為葡萄糖和果糖，即采用蔗糖底物也能夠測(cè)定出果聚糖酶的活力。因此本試驗(yàn)可采用同一底物蔗糖以同時(shí)測(cè)定蔗糖酶和果聚糖酶的活力。

圖2 菊粉和蔗糖色譜峰Fig.2 Chromatograms of inulin and sucrose

圖3 果聚糖酶酶解蔗糖的色譜圖Fig.3 Chromatograms of sucrose enzymatic hydrolysised by inulinase

2.3 糖醇轉(zhuǎn)化

通過上述水解底物篩選的討論可發(fā)現(xiàn)，蔗糖酶和果聚糖酶的活力均可通過測(cè)定酶解蔗糖后的產(chǎn)物（葡萄糖和果糖）進(jìn)行測(cè)定，若能在一次進(jìn)樣后同時(shí)將蔗糖酶和果聚糖酶的活力進(jìn)行測(cè)定，將能大大節(jié)約時(shí)間。而兩種酶的酶解產(chǎn)物均是葡萄糖和果糖，如何分別表達(dá)兩種酶的活性是試驗(yàn)的關(guān)鍵。在進(jìn)一步試驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)葡萄糖和果糖是還原性糖，能夠在適宜條件下被還原成相應(yīng)的醇。Tathod等[28]建立了一種利用雙金屬為催化劑將農(nóng)業(yè)廢棄物（C5糖、C6糖、半纖維素、菊粉和農(nóng)業(yè)廢棄物）轉(zhuǎn)化為糖醇的方法。章青等[29]公開了一種通過采用硼氫化鹽為還原劑, 將葡萄糖還原制備得到山梨醇的方法；竇光朋等[30]公開了一種利用鉬酸鹽為催化劑，使果糖和葡萄糖在加氫作用下向甘露醇和山梨醇的轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)低聚果糖廢液生產(chǎn)出甘露醇和山梨醇的方法。可見，蔗糖酶酶解并將蔗糖酶鈍化后的產(chǎn)物葡萄糖和果糖可以被還原劑還原為甘露醇和山梨醇，在此條件下再進(jìn)行果聚糖酶酶解蔗糖反應(yīng)得到其產(chǎn)物葡萄糖和果糖，產(chǎn)物便不會(huì)相互干擾。試驗(yàn)即可分別用甘露醇和山梨醇表達(dá)蔗糖酶的活力，用葡萄糖和果糖表達(dá)果聚糖酶的活力。這便是本實(shí)驗(yàn)的原理關(guān)鍵所在，見圖4。

圖4 實(shí)驗(yàn)過程原理圖Fig.4 Principle diagram of experimental process

本試驗(yàn)?zāi)芊裨谝淮芜M(jìn)樣后同時(shí)、準(zhǔn)確測(cè)定出兩種酶活力，取決于蔗糖酶解的產(chǎn)物葡萄糖和果糖能否完全轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘露醇，因此本試驗(yàn)對(duì)還原劑硼氫化鈉的用量、作用時(shí)間及作用溫度進(jìn)行了考察。

試驗(yàn)以1 mg還原糖（0.5 mg葡萄糖、0.5 mg果糖）為本底，并以轉(zhuǎn)化率（山梨醇和甘露醇的總量與葡萄糖和果糖總量的百分比值，約接近100%，轉(zhuǎn)化越徹底）為指標(biāo)，同時(shí)以色譜圖佐證，確定還原劑硼氫化鈉的用量、作用時(shí)間和作用溫度。為考察還原劑硼氫化鈉的用量，控制作用時(shí)間為30 min、溫度為40 ℃，從表4可看出，隨著硼氫化鈉用量的增加，轉(zhuǎn)化率升高，當(dāng)硼氫化鈉用量達(dá)到400 μL時(shí)已足以使葡萄糖和果糖完全還原為山梨醇和甘露醇，即轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達(dá)到100%，即0.5 mg葡萄糖和0.5 mg果糖已經(jīng)全部轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖；為考察還原劑硼氫化鈉的作用時(shí)間，控制用量為300 μL、作用溫度為40 ℃。從表5可以看出作用時(shí)間在30 min時(shí)轉(zhuǎn)化率已達(dá)到97%，60 min轉(zhuǎn)化率為98%，

表4 還原劑用量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Table 4 Effect of reductant dosage on conversion rate

表5 還原時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Table 5 Effect of reduction time on conversion rate

兩者差異不大，因此選擇還原時(shí)間為30 min；為考察溫度對(duì)糖醇轉(zhuǎn)化的影響，控制還原劑硼氫化鈉用量為300 μL、作用時(shí)間為30 min。從表6可以看出，隨著溫度的升高，轉(zhuǎn)化率也明顯升高，在溫度升至60 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%，可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。

表6 還原溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Table 6 Effect of reduction temperature on conversion rate

綜上，還原劑硼氫化鈉的用量、作用時(shí)間、作用溫度分別確定為400 μL、30 min、60 ℃，在此條件下，如圖5所示，葡萄糖和果糖色譜峰已消失，完全轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘露醇的色譜峰。在實(shí)際應(yīng)用過程中，還原劑硼氫化鈉的用量應(yīng)與樣品本底還原糖量成正相關(guān)，經(jīng)考察試驗(yàn)條件下1.0 mol/L蔗糖溶液0.8 mL，使用蔗糖酶后的水解產(chǎn)物約有還原糖3 mg，因此將還原劑硼氫化鈉的用量確定1.2 mL。該試驗(yàn)在還原劑硼氫化鈉用量為1.2 mL、作用時(shí)間為30 min，溫度為60 ℃條件下，可將本試驗(yàn)中蔗糖酶酶解產(chǎn)物果糖和葡萄糖完全轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘露醇，見圖6。

圖5 葡萄糖和果糖完全轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘露醇的色譜圖Fig.5 Chromatogram of complete conversion of glucose and fructose to sorbitol and mannitol

圖6 實(shí)驗(yàn)條件下的葡萄糖和果糖完全轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘露醇的對(duì)比圖Fig.6 Comparative chromatograms of complete conversion of glucose and fructose to sorbitol and mannitol under experimental conditions

2.4 方法對(duì)比

為驗(yàn)證本方法測(cè)定蔗糖酶和果聚糖酶活力的可靠性，將本試驗(yàn)方法測(cè)定的結(jié)果與3,5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。根據(jù)DNS法測(cè)定酶活力的原理，酶解后的產(chǎn)物為葡萄糖和果糖，兩者均為還原糖，因此均能與3,5-二硝基水楊酸發(fā)生反應(yīng)生成棕紅色氨基化合物，因此傳統(tǒng)的DNS法測(cè)得的量實(shí)際上是還原糖的總量。因此為了便于比較，本方法用水解產(chǎn)物的總量來度量蔗糖酶、果聚糖酶活力的大小。本方法與DNS法測(cè)定的蔗糖酶和果聚糖酶活力比較見表7。利用SPSS軟件對(duì)兩種方法的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果見表8。在95%置信區(qū)間百分比下，得到蔗糖酶兩種方法測(cè)定的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。萊文方差等同性檢驗(yàn)顯示，P=0.121＞0.05，即方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果為兩組方差齊性，因此兩組比較平均值等同性t檢驗(yàn)結(jié)果下的P=0.291＞0.05兩種方法測(cè)定結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同理得到果聚糖酶的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表9。其萊文方差等同性檢驗(yàn)顯示，P=0.058＞0.05，即方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果為兩組方差齊性，因此兩組比較平均值等同性t檢驗(yàn)結(jié)果下的P=0.433＞0.05，果聚糖酶的兩種方法測(cè)定結(jié)果亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且本方法的5次測(cè)定的蔗糖酶活力、果聚糖酶活力RSD分別為2.0%、1.7%，說明本方法精密度良好，綜上所述說明離子色譜-脈沖安培法同時(shí)測(cè)定蔗糖酶和果聚糖酶的活性是可行可靠的。

表7 離子色譜法與3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定的酶活力比較Table 7 Comparison of enzyme activity determined between ion chromatography-pulsed amperometric detector method and DNS method

表8 兩種方法蔗糖酶活性結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Table 8 Statistical analysis of sucrase activity by two methods

表9 兩種方法果聚糖酶活性結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Table 9 Statistical analysis of inulinase activity by two methods

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在選擇如硼氫化鈉、乙酸等為環(huán)境友好型試劑的前提下采用CarboPaCTMPA1 250mm×2 m的色譜柱，40%，100 mmol/L氫氧化鈉等度洗脫的色譜條件對(duì)甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖進(jìn)行分析測(cè)定，能滿足四種化合物測(cè)定的要求；驗(yàn)證并證明了果糖酶能夠水解蔗糖為葡萄糖和果糖，果聚糖酶活力的測(cè)定可以采用蔗糖為底物；硼氫化鈉用量為1.2 mL，作用時(shí)間30 min、作用溫度60 ℃，可以將本實(shí)驗(yàn)中的蔗糖酶解產(chǎn)物葡萄糖和果糖完全轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘露醇；最后將本方法與DNS法進(jìn)行比較，兩種方法測(cè)定的蔗糖酶活力、果聚糖酶活力均無顯著性差異（P＞0.05）；且本方法測(cè)定的蔗糖酶活力、果聚糖酶活力RSD分別為2.0%、1.7%，精密度好，即本試驗(yàn)建立的離子色譜-脈沖安培法同時(shí)測(cè)定蔗糖酶和果聚糖酶的活力方法是可行的。據(jù)本試驗(yàn)原理，蔗糖酶和果聚糖酶的加入順序是可以交換，且可以只測(cè)定其中一種酶的活力，即當(dāng)某種酶酶解產(chǎn)物可以通過離子色譜法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其酶活力是能通過離子色譜法進(jìn)行測(cè)定的。