QuEChERS-同位素質譜內標法檢測動物源性食品中20種頭孢菌素的殘留量

徐 幸，張 燕，舒 平，楊衛花

（大理州質量技術監督綜合檢測中心，云南大理 671000）

Key words：cephalosporins；isotope internal standard；LC-MS/MS；animal derived food孢菌素對革蘭氏陽性菌有抑制作用，能讓細菌在增殖階段死亡[1-2]，因其具有抗菌譜寬、抗菌效果強的特點，常被飼養者用于動物疾病的預防和治療。然而，不加控制地使用頭孢菌素可能導致其在動物源性食品中殘留累積，使消費者被動地吸收此類藥物[3-4]。頭孢菌素的殘留對人體和環境會產生以下影響：首先，干擾腸道正常菌群，導致菌群失調[5]；其次，誘導產生耐藥病原體菌株，使用抗生素治療的病人引起不良反應[6-8]；最后，動物排泄物中頭孢菌素耐藥菌株釋放到環境后會污染水體和土壤，并在污泥中長期保持耐藥性[9]。

為減少抗生素殘留給消費者帶來的影響，歐盟、美國和日本都對動物源性食品中的頭孢菌素殘留規定了限量[10]。日本限制使用的頭孢菌素類數量最多、最嚴格。在中國，GB 31650-2019《國家食品安全標準 食品中獸藥最大殘留限量》對頭孢菌素類（頭孢氨芐、頭孢喹肟、頭孢噻呋）的最大殘留限量進行了規定（見表1）。因此，建立檢測多種頭孢菌素及其代謝物殘留的方法具有重要意義。目前，對β-內酰胺類抗生素的檢測分析研究多集中于醫藥和環境領域[11-15]，而食品領域中大多數的研究文獻是關于食品中青霉素類的分析檢測，對頭孢菌素類的分析檢測文獻相對較少[16-18]。現有的關于頭孢菌素的檢測方法主要有酶聯免疫法、高效液相色譜法（HPLC）和高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[19-21]。通常傳統的HPLC-MS/MS法前處理方法步驟繁瑣，如旋轉蒸發器濃縮、固相萃取柱凈化、氮吹濃縮等步驟[22-24]。這些凈化方法費力又費時，需要使用大量的有機溶劑。因此，開發省時、方便、可靠的預處理技術已成為研究熱點。

表1 食品中頭孢菌素最大殘留限量（中國）Table 1 Maximum residue limits for cephalosporins in foods(China)

本文擬采用多個同位素內標作為定量方式建立分析市售消費量較大的動物源性食品（豬肉、牛肉、雞肉、魚肉）中多種頭孢菌素的殘留量，并對提取溶劑和凈化材料進行了優化，最終，采用QuEChERS前處理技術結合液相色譜串聯質譜分別掃描正、負離子的模式，測定20種頭孢菌素殘留的方法，并以此方法在實際樣品中進行了驗證分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

46份豬肉樣品、38份牛肉樣品、43份雞肉樣品、26份魚肉樣品 市售；頭孢氨芐（純度≥98%）、頭孢地尼（純度≥95%）、頭孢克肟（純度≥98%）、頭孢唑啉（純度≥97%）、頭孢喹肟（純度≥97%）、頭孢他啶（純度≥90%）、頭孢曲松（純度≥97%）、頭孢地嗪（純度≥97%）、頭孢替唑（純度≥97%）、頭孢噻吩（純度≥98%）、頭孢呋辛（純度≥97%）、頭孢西丁（純度≥97%）等標準品 中國食品藥品檢定研究院；頭孢拉定（純度≥97%）、頭孢匹林（純度≥97%）、頭孢哌酮（純度≥98%）、頭孢洛寧（純度≥97%）、頭孢匹羅（純度≥97%）、頭孢噻呋（純度≥98%）、頭孢呋辛酯（純度≥97%）等標準品 德國Dr.Ehrenstorfer公司；去呋喃甲酰基頭孢噻呋（純度≥90%）、頭孢呋辛D3（純度≥97%）、頭孢匹林D4（純度≥97%）、頭孢氨芐D5（純度≥98%）等標準品 加拿大TRC公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（C18）吸附劑、0.22 μm尼龍針濾頭 上海安譜科學儀器有限公司；甲酸（色譜純） Acros公司；乙腈、丙酮、甲醇、乙醇 均為色譜純，德國Merck公司；Ascentis C8色譜柱（規格為10 cm×4.6 mm，3 μm）Supelco公司；其他試劑 均為分析純。

QTRAP 4500高效液相色譜-串聯質譜儀 AB SCIEX公司；88880018型渦旋振蕩器 Thermo公司；Direct-Q3超純水機 Millipore公司；AL204型電子天平 Mettler toledo公司；TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備液的配制 準確稱取頭孢菌素標準品各10 mg（精確值0.1 mg），由于各標準品的溶解性不同，分別采用不同溶劑溶解并定容至100 mL，配制成質量濃度為100 mg/L的標準儲備液。頭孢氨芐、頭孢氨芐D5、頭孢拉定、頭孢匹林、頭孢匹林D4、頭孢洛寧、頭孢匹羅、頭孢喹肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢地嗪、頭孢替唑、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢呋辛D3等標準品采用超純水溶解；頭孢地尼、頭孢克肟、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢噻呋、頭孢呋辛酯、去呋喃甲酰基頭孢噻呋等標準品采用甲醇溶解；頭孢哌酮采用丙酮溶解。

1.2.2 樣品前處理 稱取5.00 g絞碎的樣品于50 mL離心管中，加入100 μL內標溶液（質量濃度為1.0 mg/L），加入10 mL甲醇渦旋混勻提取1 min，振蕩混勻，以轉速5000 r/min離心5 min，吸取2 mL上清液于10 mL離心管中，添加150 mg的C18吸附劑，充分振蕩1 min。將上清液采用0.22 μm尼龍針濾頭過濾，得到待檢測液，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.3 儀器分析條件 流動相：A為體積濃度為0.1%的甲酸溶液，B為乙腈。

液相色譜洗脫條件（正模式）：0～1.0 min，5% B；

1.0～8.0 min，5%～95% B；8.0～10.0 min，95% B；10.0～10.1 min，95%～5% B；10.1～14.0 min，5% B。

液相色譜洗脫條件（負模式）：0～1.0 min，40%B；1.0～3.0 min，40%～95% B；3.0～3.1 min，95%～5%B；3.1～7.5 min，5% B。

流速：0.50 mL/min；進樣量：1 μL；柱溫：40 ℃。

質譜條件：離子源為ESI源；噴霧電壓：5500 eV；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；掃描方式多重反應監測模式（MRM）條件見表2。

表2 多反應監測條件Table 2 Parameter of MRM

1.2.4 方法驗證

1.2.4.1 標準曲線的繪制 采用甲醇/水（體積比1:2）混合溶劑稀釋標準儲備液，由于各標準物質在儀器上的響應值不同，分別配制成高響應值的頭孢菌素混合標準溶液（17種），質量濃度為5、10、20、40、60、80、100 μg/L的標準曲線，低響應值的頭孢菌素混合標準溶液（3種，頭孢匹羅、頭孢喹肟、頭孢曲松），質量濃度為25、50、100、200、300、400、500 μg/L的標準曲線。準確吸取頭孢呋辛D3、頭孢匹林D4、頭孢氨芐D5等內標儲備液，配制進各質量濃度水平的混合標準溶液，得到內標的質量濃度為10 μg/L，供液相色譜-串聯質譜聯用儀測定，以頭孢菌素與同位素內標的質量濃度比值為橫坐標，頭孢菌素與同位素內標的峰面積比值為縱坐標來繪制標準曲線。

1.2.4.2 添加回收實驗 分別在不同基質樣本中（豬肉、牛肉、雞肉、魚肉）添加3個水平濃度的標準溶液，根據各標準物質在儀器上的響應值，17種響應值較高的化合物（頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢匹林、頭孢洛寧、頭孢他啶、頭孢地嗪、頭孢替唑、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢地尼、頭孢克肟、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢噻呋、頭孢呋辛酯、去呋喃甲酰基頭孢噻呋、頭孢哌酮）添加水平為10、40、80 μg/kg，3種響應值較低的化合物（頭孢匹羅、頭孢喹肟、頭孢曲松）添加水平為50、200、400 μg/kg。

1.3 數據處理

采用HPLC-MS/MS進行分析檢測，每個樣品進樣測試2次，HPLC-MS/MS數據采集使用AB SCIEX Analyst software軟件，數據的統計分析采用Microsoft Excel 2007軟件，處理數據和繪圖采用Origin 8.0和Photoshop CS6軟件。

2 結果與分析

2.1 HPLC-MS/MS儀器分析條件的優化

采用HPLC-MS/MS分析的過程中，流動相的組成會影響化合物的峰形和響應值。本文考察了4種流動相組合模式的分析效果，分別為：水和乙腈、水和甲醇、0.1%甲酸水溶液和乙腈、5 mmol/L醋酸銨水溶液和乙腈。結果表明，大多數化合物在0.1%甲酸水溶液和乙腈流動相體系中的峰形和響應值都較好，最終，選擇0.1%的甲酸水溶液和乙腈體系作為本實驗分析的流動相。

本實驗嘗試采用相同的梯度洗脫程序同時掃描正、負離子，然而效果并不理想，因此，經過優化梯度洗脫程序，本文采用不同的梯度洗脫程序分別掃描正、負離子，正離子掃描模式洗脫程序用于分析14個頭孢菌素和2個同位素內標（頭孢氨芐D5和頭孢匹林D4），負離子掃描模式洗脫程序用于分析6個頭孢菌素和1個同位素內標（頭孢呋辛D3），頭孢菌素的離子對掃描條件見表2中，各種頭孢菌素化合物的多反應監測MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 頭孢菌素標準溶液的多反應監測色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of cephalosporins standard solution

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取溶劑和吸附劑的選擇 頭孢菌素的極性與其分子結構中含有的官能團有關，大多數頭孢菌素可以溶解于極性溶劑。在本實驗中，考察了3種極性溶劑從動物源性食品基質中提取頭孢菌素的效果，分別為乙腈、甲醇、乙醇。同時，采用C18和PSA吸著劑作為凈化材料來減少由基質引起的干擾，C18吸附劑由于碳含量占比10%而具有疏水性，可以吸附非極性和弱極性的物質，主要是樣品中的脂類、多環芳烴和鄰苯二甲酸酯類。PSA吸附劑有弱陰離子交換作用、極性相互作用和絡合作用，可以吸附各種極性色素、脂肪酸和有機酸[25]。如圖2所示，采用乙腈作提取溶劑時，多種頭孢菌素的回收率都很低，而采用甲醇與乙醇作提取溶劑時，回收率更高。此外，與采用PSA相比，采用C18作為凈化吸附劑的回收率相對較高。結果顯示，大多數頭孢菌素可能被PSA吸附，分析原因可能是PSA吸附劑的氨基與頭孢菌素的羧基發生相互作用有關（如圖3所示），而C18吸附劑含有的烷基則不會與頭孢菌素發生這種相互作用。因此，本實驗最終選擇甲醇為提取溶劑，采用C18吸附劑作為凈化材料。

圖2 不同提取溶劑和吸附劑對頭孢菌素回收率的影響Fig.2 Effects on recovery of cephalosporins under different solvent and sorbent

圖3 C18和PSA吸附劑作用于頭孢菌素的可能機制Fig.3 Possible mechanism for C18 and PSA sorbents on cephalosporins

2.2.2 吸附劑用量的優化 本實驗考察了使用不同劑量的吸附劑對頭孢菌素回收率的影響，采用C18吸附劑作為凈化材料時，吸附劑使用量的變化對大多數頭孢菌素的回收率沒有影響，而有5種頭孢菌素的回收率會受到影響，如圖4所示，當C18吸附劑的使用量從75 mg增加到200 mg的過程時，5種頭孢菌素（頭孢地尼、頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢地嗪和頭孢西丁）的回收率逐漸增加，導致這種現象的原因可能與這5種頭孢菌素的分子量較大，含有的氨基較多，提取液中一些脂類物質可能會與頭孢菌素的氨基發生相互作用，使這些頭孢菌素被雜質吸附，導致回收率較低，而當使用C18吸附劑凈化處理樣品提取液時，提取液中的脂質與C18吸附劑發生相互作用，使最初與脂質發生作用的頭孢菌素被釋放出來，從而提高了回收率。作為對比實驗，也采用相同的實驗方法考察PSA吸附劑對頭孢菌素的影響，結果表明，大多數頭孢菌素的回收率隨著PSA吸附劑用量的增加而逐漸降低（圖4），這也進一步驗證了上一步實驗的推論，PSA吸附劑會與頭孢菌素發生相互作用。考慮到凈化效果和節約因素，最終本實驗采用150 mg的C18吸附劑用于凈化提取液。

圖4 不同劑量的吸附劑對頭孢菌素回收率的影響Fig.4 Effects of different dosage of sorbent on recovery rate of cephalosporins

2.3 方法驗證

2.3.1 基質效應 基質是除被測組分以外的其他物質，如磷脂、膽固醇和其它內源性物質，當這些組分進入質譜儀時，液滴蒸發產生的氣體離子可能與液體表面的目標離子發生競爭作用，這將導致目標離子的電離效率減少或增強，然后導致目標物響應值的減少或增加[26-27]，這種現象就是基質效應。本實驗中，頭孢菌素基質效應的計算方法為：基質配制標準曲線的斜率與溶劑配制標準曲線斜率的比值[25]。如表3所示，本實驗中的20種頭孢菌素的基質效應從0.368到0.768不等，這個結果表明，在動物源性食品中，樣品的基質效應是明顯的，因此，為減少基質效應帶來的影響，采用添加穩定性同位素內標的方法來解決這個問題。

表3 不同動物源性樣品的基質效應Table 3 Matrix effect for cephalosporins in different animal derived matrices

2.3.2 線性方程、檢出限和定量限 頭孢菌素的線性方程采用外標物與內標物的比值繪制，各線性方程見表4，其中X是頭孢菌素外標物質與同位素內標的質量濃度比值，Y是頭孢菌素外標物質與同位素內標的峰面積比值，本實驗一共使用了3種同位素物質作為內標，每一種化合物對應使用的具體內標物見表4，線性方程的決定系數（R2）范圍從0.9913到0.9998。方法檢出限（LOD）為3倍信噪比的檢測濃度，定量限（LOQ）為10倍信噪比的檢測濃度，根據儀器的檢測信號值，這20種頭孢菌素LOD的范圍為1.0～20.0 μg/kg，LOQ的范圍為3.0～60.0 μg/kg。

表4 線性方程、檢出限和定量限Table 4 Linear equation, LOD and LOQ of cephalosporins

2.3.3 準確度和精密度 以準確度和精密度評價方法的有效性，對20種頭孢菌素分別在4種基質（豬肉、牛肉、雞肉、魚肉）中，添加3個濃度水平的回收實驗，每個濃度水平進行6次平行實驗。回收率結果見表5，在不同基質中，頭孢菌素的平均回收率范圍在78.08%～115.47%之間，相對標準偏差（RSD）的范圍為3.07%～12.44%，回收率實驗表明，該方法的準確度和精密度滿足實驗要求。

表5 不同基質中頭孢菌素的回收率和精密度（n=6）Table 5 Recovery and RSD of the cephalosporins in different matrices (n=6)

2.3.4 方法在實際樣品中的應用 為驗證穩定同位素質譜內標法測定動物源性食品中20種頭孢菌素的可行性，從當地市場上采集了46個豬肉樣品、38個牛肉樣品、43個雞肉樣品和26個魚肉樣品，以本實驗建立的檢測方法進行分析，結果顯示，在2個

魚肉樣品中檢出頭孢匹林，含量分別為7.3和12.1 μg/kg，不符合現有對食品中頭孢菌素殘留的規定，未檢出其它頭孢菌素，出現這個結果可能是由于養殖魚類的過程中使用了頭孢匹林，或者魚類生活的水體被污染了。

3 討論與結論

本文以甲醇作為提取溶劑，以C18吸附劑作為凈化材料用于動物源性食品的前處理，結合同位素質譜法分析檢測了20種頭孢菌素，并對前處理和儀器參數進行了優化，最終，建立了同位素質譜內標法測定動物源性食品中20種頭孢菌素的方法，并對方法進行了驗證。結果表明，本文所建立檢測方法的線性方程、準確度、精密度和檢出限等參數都滿足檢測需求，在實際樣品中的應用效果較好。表明該檢測方法是準確可靠、簡便的，可用于日常對動物源性食品中的頭孢菌素的監測分析。由于目前國家標準GB 31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》僅對3種頭孢菌素類（頭孢氨芐、頭孢喹肟、頭孢噻呋）在牛、豬等食品中的最大殘留限量進行了規定，本文對其它類型的頭孢菌素也進行檢測分析，并擴展到其它類型的樣品（雞肉、魚肉），對進一步了解市場上動物源性食品中頭孢菌素的殘留情況具有現實意義，受同位素標準物質的種類限制，部分化合物使用同位素內標的回收率還有待提高，今后如果有更多的同位素標準物質可以選擇，會更加完善此法的效果。