甲硫氨酸亞砜還原酶及其調控果蔬逆境脅迫的研究進展

付曉東，趙修明，劉 炅，張新華，李富軍，李曉安

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東淄博 255049）

甲硫氨酸亞砜還原酶（methionine sulfoxide reductase，Msr）是廣泛存在于動植物及微生物體內的一種氧化還原調節酶，在生物代謝過程中參與細胞防御和抗衰老過程，是細胞內重要的抗氧化酶。它可以通過兩方面保護細胞免受氧化損傷，一方面可以修復因甲硫氨酸（methionine，Met）氧化而失活的蛋白[1]。Met是構成生物體內多肽和蛋白質的重要氨基酸，但Met易被H2O2及羥自由基等活性氧（reactive oxygen species，ROS）氧化成為甲硫氨酸亞砜（methionine sulfoxide，MetSO），導致含Met的蛋白質的生物學活性降低或喪失。而Msr可以將生物體內的MetSO還原為Met，使蛋白質重新恢復活性[1-2]。另一方面Msr可以在細胞中發揮抗氧化修復因子的作用，清除細胞中的ROS[1]。

果蔬在逆境脅迫下以及采后衰老過程中，機體內ROS的平衡體系會破壞，使得大量的O2-.、H2O2等在體內積累，導致氧化損傷，如改變細胞內生物大分子（蛋白質、DNA等）的結構和功能，造成蛋白質失活、DNA斷裂，細胞膜的過氧化等[3-6]，進而導致果蔬衰老以及病害的發生。據報道，全球果蔬浪費損失高達45%，造成巨大的經濟損失[7]。但Msr可以通過恢復蛋白活性、維持清除ROS的能力等增強果蔬對脅迫的抗性，減少損害，保持果蔬品質[4,8]。本文就Msr的分類、作用底物、編碼基因的研究進展以及其在果蔬衰老及逆境脅迫響應中的作用及機制進行了綜述，以期為Msr在果蔬代謝調控方面的進一步研究和利用提供參考。

1 Msr的分類

Met是含硫氨基酸之一，其中的硫原子極易被氧化[9]，硫原子的手性被氧化后形成S型和R型兩種非對映異構體的MetSO，分為甲硫氨酸-S-亞砜（Met-S-SO）和甲硫氨酸-R-亞砜（Met-R-SO），二者共存且等量[9]。對應的有兩種特異性Msr將MetSO還原為Met，分別為MsrA和MsrB[10]。MsrA特異性催化游離態和蛋白質中Met-S-SO還原為Met；MsrB特異性催化游離態和蛋白質中Met-R-SO還原為Met，但相比于MsrA催化游離態的能力，MsrB催化游離態Met-R-SO的能力很弱[11-12]。2007年，研究人員在大腸桿菌中發現了一種新的、可以特異性高效催化游離態Met-R-SO的酶，命名為fRMsr[10]。

MsrA[13]、MsrB[14]最早均在大腸桿菌中被發現，廣泛存在于細菌、酵母、植物和哺乳動物等生物體中。MsrA與MsrB的蛋白結構不同[15]，但兩個亞家族各自具有相似的結構。通過對MsrA的序列研究發現，MsrA在催化過程中半胱氨酸（cysteine，Cys）殘基在位置和數目上具有相似性和特異性，大致可以分為三類：含有3個保守的Cys殘基，分別位于Cys51、Cys198、Cys206（數字代表大腸桿菌Msr序列中氨基酸殘基位置，下同），植物中的Msr大體屬于Cys51類，只有Cys51位于“GCFWG”保守序列，其中“GCFW”廣泛存在于MsrA中，是鑒定MsrA的主要依據[16]；含有兩個保守的Cys殘基，其中Cys51也位于“GCFWG”保守序列，第二個Cys位于“GYCH”或“GYXCH”中；僅由兩個Cys殘基且同時位于保守結構域“GCFWC”中[17]。MsrB分為兩類：含有兩個額外的“CxxC”保守基序，由4個保守的Cys殘基構成，可以結合Zn2+，若保守Cys殘基突變，則酶的活性全部喪失，植物中的MsrB大體屬于這一類；相較于前者少一個“CxxC”保守基序，不能結合Zn2+[7,16]。fRMsr只存在于單細胞生物，多細胞生物中不存在[10]，也分為兩類：含有三個保守Cys殘基；含有兩個保守的Cys殘基[17]。

不同Msr的催化過程會有差異，也會受到不同反應的調控[18]，這可能會影響Msr在果蔬逆境脅迫中的調控能力。此外，Msr分類的細化，說明Msr的類別可能在Msr的調控機制中具有重要的地位[16]。

2 果蔬Msr的作用底物

在動物和微生物中的研究發現，HIV-2蛋白酶、鈣調素（calmodulin，CaM）、Ca2+/CaM依賴的蛋白激酶II（CaMKII）、載脂蛋白A-I、轉錄因子HypT等已經被鑒定為Msr的底物[19-20]。在植物中，最早發現的Msr底物是小分子熱激蛋白sHSP21[20]；CaM作為細胞調節分子可以間接調控鈣調素結合蛋白發揮作用，研究發現CaM不僅是動物和微生物體內Msr的底物，同時也是果蔬中Msr的底物[19,21-22]。另外，近年來研究發現，在果蔬中Msr還可以與抗氧化酶、轉錄因子、信號分子、蛋白激酶等多種類型的蛋白相互作用（表1）。如，在香蕉中研究發現，MaMsrB2可與抗壞血酸過氧化物酶1（ascorbate peroxidase 1，APX1）[23]及轉錄因子MaNAC42[24]相互作用，均可通過還原MetSO為Met，恢復蛋白的活性；Sun等[25]發現在大豆幼苗中，GsMsrB5a可以與Ca2+/CaM依賴的激酶GsCBRLK相互作用，并激活碳酸鹽脅迫下幼苗中的活性氧信號[25]。除蛋白質外，一些多肽、氨基酸衍生物等也可以作為Msr的底物。比如，白菜中BpPMsr3可以通過與谷胱甘肽作用，恢復谷胱甘肽的活性[26]。果蔬中Msr還可以與外源生物蛋白相互作用，Gao等[27]發現Papaya ringspot virus（PRSV）中的核內涵體蛋白a蛋白酶（nuclear inclusion protein a protease，NIa-pro）可以與宿主番木瓜中的PaMsrB1相互作用，阻止PaMsrB1進入葉綠體發揮功能。

Msr與底物的相互作用是其參與調控果蔬逆境脅迫的重要機制，由上述可知，果蔬中Msr的作用底物類型多樣，因此Msr在果蔬的各種脅迫反應中可能發揮重要作用。但目前對于果蔬中Msr作用底物的研究仍非常有限，加大對Msr作用底物的研究力度，有助于進一步揭示Msr的作用機制。

3 果蔬Msr基因家族

Msr基因家族具有很高的序列同源性，但MsrA和MsrB兩個亞家族的基因基本不存在序列相似性。目前已知在番茄中存在5種MsrA（分別為SlMsrA（E4）、SlMsrA2～A4、SlPMsrA5）基因和3種MsrB（SlPMsrB1、SlMsrB2、SlPMsrB5）基因。亞細胞定位預測了下列蛋白質的位置（表1），分析顯示SlMsrA預測定位于葉綠體、細胞質和細胞核中[28-29]，SlMsrA3在細胞核中，SlMsrA4定位于葉綠體和細胞核，SlPMsrA5主要在葉綠體中，SlPMsrB1在細胞膜和細胞核中[30-31]，SlPMsrB5有兩個可變剪切體，SlPMsrB5.1和SlPMsrB5.2，它們表達的蛋白均定位在細胞核中。在草莓中，目前已發現了3種Msr基因（FaMsrA、FaPMsr、FaPMsr1），其中，FaMsrA編碼的蛋白質與番茄中的SlMsrA編碼的蛋白質具有相似的功能。蛋白質FaMsrA和FaPMsr預測定位在細胞質和細胞核中，而FaPMsr1定位于細胞核中。在馬鈴薯中，已知有7種Msr編碼基因（StPMsr、StPMsrA1、StPMsrA3、StPMsrA5、StPMsrB、StPMsrB1、StPMsrB5），其中StPMsr、StPMsrA3、StPMsrB、StPMsrB5均定位于細胞核中，StPMsrA1定位于細胞壁、細胞核和葉綠體中，而StPMsrA5定位于葉綠體中；StPMsrB1有兩種可變剪切體為StPMsrB1.1、StPMsrB1.2，兩者表達的蛋白均定位于細胞核中。

表1 果蔬Msr的種類及作用底物/研究機制Table 1 Types and substrates/research mechanisms of Msr in fruits and vegetables

由此可知，在果蔬作物中存在多個Msr基因家族及編碼基因。進一步研究發現，不同的Msr亞型的基因在果蔬作物中的表達模式也有較大的差異。番茄中SlMsrA的表達受乙烯誘導，而且僅在成熟果實中表達，其他器官中不表達[30-31]；而SlMsrA2在所有器官中均有表達，但在紅熟期果實中表達量最高；SlMsrA3和SlMsrA4在葉和花中的表達量更高，而SlMsrA5在根、葉、莖和紅色果實中幾乎不表達，但在花中有相對較高的表達[28]；SlMsrB1在葉、花和紅熟期的番茄果實中均有較高的表達[31]。草莓中也有一種FaPMsr只在紅色成熟果實中表達[32]；在茄子果實發育過程中，SmMsrA的表達水平在開花日最高[33]。另外，Oh等[34]研究表明，通常胞質型Msr在根中被特異性表達，而質體型Msr則主要在發生光合作用的光合器官中被表達，如CaMsrB2在辣椒的葉、花和莖中的轉錄水平遠遠高于根。上述研究表明，Msr基因在果蔬作物生長發育的不同階段特異性表達，可能與它們功能的發揮密切相關，隨著果蔬的生長發育發揮相應功能，以促進果蔬作物的正常生長[35]。

4 Msr在果蔬代謝及逆境脅迫中的調控作用

4.1 Msr在果蔬成熟衰老中的調控作用

根據衰老的自由基理論，有氧呼吸導致ROS的產生，ROS引起蛋白質、脂類、DNA等大分子的氧化損傷，從而促進衰老過程，抗氧化應激和降低氧化損傷（即消除ROS和修復氧化蛋白）是維持蛋白質功能和調節衰老的關鍵[36]。在一些細胞、組織和生物體中，過表達Msr可能會延長壽命或增加抗氧化應激能力，而缺失或突變的Msr則會縮短壽命或降低抗氧化應激能力[37]。例如在平菇中，與野生型相比，過表達PoMsrA的菌株對H2O2耐受能力顯著增強，菌絲生長速度明顯提高，菇體的衰老速度明顯下降[38]。

Msr參與調控果蔬成熟衰老的機制比較復雜，可以通過與成熟相關的轉錄因子相互調控，參與各種成熟相關的反應。例如，在番茄中研究表明SlMsrA的表達受乙烯的強烈誘導[29]；并且對轉錄因子NOR氧化損傷有明顯的修復作用，可以逆轉因NOR亞砜化導致的番茄成熟相關基因轉錄活性的降低[39]。另外，SlMsrA和SlMsrB2的轉錄活性也受NOR的調控[40]，Skelly[41]研究表明，NOR可以與SlMsrA和SlMsrB2啟動子中的TATA盒結合并激活它們的表達，促進果實的成熟[39]。而在獼猴桃采后貯藏過程中，乙烯會通過誘導轉錄因子AdNAC2和AdNAC72靶向激活AdMsrB1的表達，而且AdMsrB1的超表達也可以增加乙烯合成的直接前體ACC的含量，或者發揮酶活性將MetSO還原為Met補充乙烯合成過程中的前體，維持乙烯的高效合成[42]。

Msr還可以通過酶促系統、蛋白質的氧化還原修飾、激素等多種方式間接調控果蔬成熟[24]。APX是一種重要的抗氧化酶，可以與抗氧化酶系統相偶聯調節ROS的水平，參與植物多種發育生理過程和應激反應。在香蕉中的研究發現，MaMsrB2可還原MaAPX1中被氧化的Met殘基，恢復MaAPX1的活性，調節果實的成熟衰老過程[23]。另外，Jiang等[22]通過轉錄組分析發現，在香蕉成熟衰老過程中MaMsrA7與MaCaM1的表達均快速上調，而且MaMsrA7可修復MaCaM1的亞砜化修飾，從而促進了MaCaM1介導的果實抗氧化反應和類胡蘿卜素生物合成相關基因的轉錄。在荔枝中，被氧化的LcCaM1可以與衰老相關轉錄因子LcNAC13和LcWRKY1相互作用增強這兩個轉錄因子結合DNA的活性，而LcMsrA1和LcMsrB1還原LcCaM1中被氧化的Met殘基，從而抑制衰老進程[19]。

Msr也受外源物質的調控，參與外源物質介導果蔬抗衰老的過程。例如，褪黑素及α-硫辛酸處理延緩荔枝果實的衰老或果皮的褐變也與LcMsrs表達的上調密切相關[43-44]；L-鹽酸半胱氨酸可以通過維持龍眼果實中DlMsr、DlMsrA5和DlMsrB2的表達水平減緩果實衰老進程[9]。另外，植物磺肽素延緩草莓果實的衰老和腐爛也與誘導Msr和過氧化物酶基因的表達、維持抗氧化相關酶的活性密切相關[45]。茄子中SmMsrA可以調控多胺的含量進而影響茄子單性結實[46-47]。這表明，Msr在果蔬的生長、成熟、衰老的各個階段均發揮重要作用。

4.2 Msr在果蔬非生物脅迫響應中的調控作用

果蔬在生長發育過程中會遇到多種非生物脅迫（極端溫度、干旱、鹽堿、洪澇、輻照、化學物質等）因素的影響[48]。研究發現，逆境脅迫會誘導果蔬體內多種Msr基因的表達，有助于清除大量產生的ROS，在調控果蔬非生物脅迫抗性中發揮重要作用[7]（圖1）。異源表達擬南芥基因AtMsrB7、AtMsrB8、AtMsrB9的番茄葉片，抵抗甲基精紫（methyl viologen，MV）氧化脅迫的能力明顯增強，表明Msr在植株響應MV脅迫中發揮重要作用[49]。響應于H2O2處理，番茄SlMsrA表達量顯著升高，維持了番茄幼苗的抗氧化能力[50]。

圖1 Msr基本功能機制原理圖Fig.1 Schematic diagram of the basic functional mechanism of Msr

干旱和鹽堿嚴重限制果蔬的存活能力。利用甘露醇和氯化鈉模擬干旱和高鹽脅迫處理番茄幼苗[50]和平菇[38]，檢測到SlMsrA和PoMsrA表達量均顯著增加；SlMsrB2可以通過修復核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基3B和過氧化氫酶2來提高葉綠素含量和清除ROS以增強抗旱能力[51]，表明Msr在果蔬響應干旱和鹽脅迫中也發揮了重要作用。

極端溫度是影響果蔬作物生長發育和果實品質的重要環境因素之一，Msr在植物低溫脅迫響應中也發揮重要作用。桃果實遭遇低溫脅迫時，激酶[21]、赤霉素[52]均可以提高PpMsrs的表達量，抵抗低溫脅迫造成的氧化損傷[21,52]；在平菇中，32 ℃高溫處理會顯著增強PoMsrA的表達，增強菇體的抗熱性和抗氧化能力[38]。

隨著現代工業的發展，金屬離子對果蔬傷害的機率日益增加。根據蛋白質組學分析發現，銅和鎘脅迫會導致芥菜細胞質中BjMsrA2的表達明顯增加[53]；胡蘿卜中鎘脅迫會上調Msr的表達以應對鎘脅迫導致的氧化損傷[54]；異源表達大白菜BpPMsr3的擬南芥幼苗在鎘脅迫下的存活率也顯著上升[26]。在其他類型植物中存在Msr與銅離子螯合的方式來增強銅脅迫的抗性[55]，推測果蔬中可能也存在類似的機制。

4.3 Msr在果蔬生物脅迫響應中的調控作用

果蔬作物生長發育過程中也經常遭受細菌、真菌、病毒或害蟲的侵害，Msr在調控果蔬作物響應這些生物脅迫中也發揮了重要作用。由Xanthomonas axonopodis pv Vesicatoria（Xav）導致的細菌斑點病是甜椒的重要病害之一，利用病毒誘導基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術沉默CaMsrB2會降低病程相關蛋白（pathogenesis-related proteins，PR）基因CaPR4和CaPR10的表達，增加甜椒對Xav的敏感性[34]；而在番茄中超表達CaMsrB2會促進防御相關基因SlP1、SlPR-1b和SlP23等的表達，增強植株的抗病性[34]。Dai等[28]發現SlMsrA2-5的表達可被水楊酸（salicylic acid，SA）處理明顯誘導，推測SlMsrAs可能參與了番茄的病害防御過程。

Msr作為一種重要的ROS調節酶，可調節防御蛋白中Met的氧化還原狀態和細胞的氧化狀態，是果蔬防御體系的重要因子[34]。因此，Msr也成為病毒或細菌等病原體防御機制攻擊的靶點。NIa-Pro是PRSV中的一種多功能病毒非結構蛋白，在PRSV侵染番木瓜后NIa-Pro可以與PaMsrB1直接互作，干擾PaMsrB1進入葉綠體發揮清除ROS和修復葉綠體受損蛋白的功能[27,56]。

4.4 Msr參與信號分子介導果蔬代謝

Msr在多種信號分子[ROS、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）、激酶、植物激素]介導的果蔬生長發育和防御過程中也發揮了重要作用[57]。

ROS在植物體內具有雙重作用，高濃度的ROS會導致細胞氧化損傷，喪失正常的生理功能；而低濃度的ROS可作為信號分子調控抗性基因和防衛基因的表達，在果蔬的生長發育及逆境響應中發揮積極作用[34]。例如，在桃果實中，ROS增加線粒體蛋白質羰基化進程[58]，同時也誘導相關Msr的表達，延緩果實衰老、增加抗氧化能力。在辣椒中研究表明，CaMsrB2可調控辣椒防御反應期間ROS的產生，而該ROS在由不相容病原體引起的超敏反應（hypersensitivity，HR）中發揮重要作用。另外，脅迫產生的ROS也可誘導多種果蔬作物體內Msr基因的表達，還原抗氧化蛋白中被氧化的Met，進而恢復清除ROS的能力[35]。

RNS是另一種與ROS緊密相關的氧化劑分子，如一氧化氮（nitric oxide，NO）與超氧化物反應產生的過氧亞硝酸鹽，高濃度下也會氧化破壞生物大分子，但在基礎水平上，可作為改變細胞氧化還原穩態的信號，通過提高Msr的表達、抗氧化酶的活性以及抗氧化物質的含量，抑止脂質過氧化作用，清除部分ROS[4,59]，在果蔬的發育及逆環境脅迫的反應中發揮重要的調控作用[35]。

激酶也可以調控Msr的表達，桃果實中糖原合成酶激酶3（GSK-3）可以上調包括Msr在內的抗氧化酶基因的表達，增強果實抗冷性[21]。肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）[60]、γ-氨基丁酸[61]等可以調控Ca2+介導的信號通路或者增強Msr-Trx系統提高Msr等抗氧化酶基因的表達，增強抗氧化能力。

植物激素對Msr的調控具有雙面性，一部分植物激素可以顯著提高Msr的表達。如番茄幼苗響應于外源脫落酸和SA處理，SlMsrA表達量顯著升高，表明SlMsrA可能參與了SA介導番茄幼苗抗病過程[28,54]。另外，有研究表明激素也會通過抑制Msr的表達，調控果蔬作物的生長。如正常情況下，草莓的FaPMsr只在紅熟期果實的花托中表達，在其它組織中均檢測不到；但當未熟的綠果在花托上被摘除時，果實中FaPMsr的表達可被顯著激活，而外源應用生長素（如萘乙酸）可抑制此激活過程[32]。在辣椒中，響應于SA、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和乙烯處理，CaMsrB2的表達明顯下調，加速ROS的積累，從而在病害位置引起HR，表明CaMsrB2積極響應防御信號[34]。

綜上所述，果蔬在成熟衰老及遭受各種生物和非生物脅迫過程中會產生大量ROS，一方面會導致果蔬發生氧化損傷；另一方面，ROS也可誘導Msr等果蔬體內防御機制的啟動。Msr可以通過還原被氧化的Met修復各種蛋白質，其中包括抗氧化酶、轉錄因子、鈣調蛋白等，維持蛋白質在各自的代謝網絡中發揮相應的功能；另外，Msr也可以參與NO、GA、SA以及乙烯等多種信號分子介導的果蔬代謝過程，是信號分子調控果蔬代謝的重要機制之一（表1）。

5 結語與展望

盡管近年來對于果蔬中Msr蛋白的結構、生理功能、作用底物以及基因表達模式等已開展了大量的研究工作，但相較于動物、微生物及模式植物中Msr的研究還有較大的差距。如，許多果蔬作物中Msr的編碼基因還沒得到鑒定、多數果蔬中Msr蛋白的具體作用機制仍未研究透徹、果蔬中Msr底物的研究仍然不足，對于龐大的信號網絡的交互知之甚少。另外，關于Msr具體如何協調酶促系統和非酶促系統清除ROS也有待更深入的研究。鑒于Msr家族在果蔬各種代謝途徑中的重要作用，其在實際應用中的價值也有待開發，如Msr活性的增加可以增強果蔬抵抗低溫、鹽堿、干旱等逆境脅迫，是否可以通過轉基因技術應用到其他經濟作物中，或通過育種篩選具有優良Msr基因的果蔬等。隨著分子生物學技術的發展，對果蔬Msr的研究帶來很大的幫助，今后可借助VIGS技術、CRISPR/Cas9基因編輯技術及組學技術等更廣泛的鑒定果蔬作物中未知的Msr，揭示其編碼基因的序列，深入挖掘其生理功能及作用機制，為果蔬作物品質的改良、逆境抗性的調控奠定理論基礎。