高通量測序在2例腎病綜合征并發感染患者病原診斷中的應用

陳樹娟，李虎才，王立新

(1. 廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510000； 2. 廣州中醫藥大學第二附屬醫院腎內科，廣東 廣州 510120)

腎病綜合征(nephrotic syndrome, NS)患者由于免疫功能受損及使用糖皮質激素、免疫抑制劑等導致其免疫功能低下，常出現嚴重的細菌、真菌、病毒等混合性感染。感染起病隱匿，臨床癥狀不典型，病情進展迅速，是導致NS患者全因死亡的主要原因[1]。由于檢測技術的限制、抗菌藥物的使用及免疫功能低下等，傳統檢測技術對致病菌總體檢出率偏低，且檢測耗時長，給臨床診斷及治療帶來困難。分子診斷和基因診斷是目前感染性疾病病原學診斷中的一個重要方向和研究熱點，高通量測序即下一代測序技術(next-generation sequencing, NGS)，利用現有微生物群基因信息群，采用生物信息學方法，與測序結果比對，進而鑒別微生物種類，具有檢測耗時短、覆蓋面廣等優點。近年來NGS廣泛應用于血流感染、肺部感染、中樞神經系統感染等多種感染性疾病，因其可快速檢測和全面識別病原菌，且病原菌陽性檢出率遠高于傳統檢測，具有顯著的優勢及應用價值[2-4]。目前關于NGS在NS并發感染中的研究報道較少。本文通過分析某院利用NGS明確診斷NS并發隱球菌感染及嗜麥芽窄食單胞菌腦膜炎各1例，探討NGS在NS并發感染中的應用。

1 病歷資料

1.1 病例1 患者女性，58歲，2021年10月25日因“發現雙下肢浮腫6個月余，發熱咳嗽10 d”收入我科，既往有高血壓病史。6個月余前，患者因NS行腎穿活檢診斷為Ⅲ期膜性腎病，予足量糖皮質激素及環磷酰胺治療。10天前患者出現咳嗽、咯痰伴發熱，體溫最高達39.5℃，于外院行實驗室檢查：血白細胞計數12.49×109/L，中性粒細胞百分比88.5%，C反應蛋白(CRP)205.56 mg/L，降鈣素原(PCT)0.129 ng/mL，血沉104 mm/h；尿白細胞計數158個/μL；痰培養檢出白念珠菌。胸部CT提示左肺下葉見斑片狀高密度影，考慮左肺下葉炎癥。先后予頭孢呋辛、哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉抗感染，病情無好轉，為進一步治療，入我科。

入院時患者精神疲倦，咳嗽，干咳少痰，發熱，雙顳部及頸部輕度疼痛。查體：體溫38.6℃，聽診雙肺呼吸音粗，雙下肺可聞及散在濕啰音，頸軟，無抵抗，凱爾尼格征及布魯津斯基征陰性，生理反射存在，病理反射未引出。實驗室檢查：血白細胞計數6.35×109/L，中性粒細胞百分比74.5%，淋巴細胞百分比15.5%，CRP 45.38 mg/L，PCT 0.06 ng/mL，血沉72 mm/h，血肌酐 38 μmol/L；尿白細胞計數70.6個/μL；淋巴細胞亞群：CD4+T淋巴細胞(CD3+CD4+)31.39%，CD4+T淋巴細胞亞群/CD8+T淋巴細胞亞群0.97。胸部CT平掃提示雙下肺感染，診斷為NS并發感染。患者長期使用糖皮質激素及免疫抑制治療，外院抗感染無效，考慮存在細菌、真菌、病毒等混合感染可能，經驗性予舒普深(3 g，q12h)+氟康唑(0.2 g，qd)+更昔洛韋(0.3 g，q12h)靜脈滴注抗感染治療。留取淺部痰、尿、血標本行細菌、真菌病原學培養以及肺炎支原體、抗巨細胞病毒(CMV)-IgM、CMV、呼吸道病毒、曲霉菌GM抗原等檢測均為陰性。遂完善支氣管鏡檢查，留取深部痰及肺泡灌洗液行病原菌培養，肺泡灌洗液行NGS檢測，深部痰及肺泡灌洗液培養均為陰性，NGS結果提示隱球菌感染。患者腦膜刺激征陰性，但存在雙顳部及頸部疼痛，考慮隱球菌與中樞神經系統有高度親和性，行腰椎穿刺檢測回報腦脊液常規：白細胞計數106×106/L，中性粒細胞13%，淋巴細胞87%；腦脊液生化：葡萄糖1.87 mmol/L，蛋白550 mg/L；血清、腦脊液隱球菌莢膜多糖抗原陽性；腦脊液墨汁染色、細菌培養均陰性。患者NS并發隱球菌性肺炎及腦膜炎可診斷。調整抗感染方案，氟康唑加量(0.4 g，qd)+舒普深(3 g，q8h)靜脈滴注，患者發熱趨勢較前下降，病情平穩后出院，門診規律復診。

1.2 病例2 患者女性，73歲，2021年10月15日因“反復腹痛半月余”入我院外科，既往有高血壓、糖尿病病史。患者半月余前無明顯誘因出現上腹部及臍周隱痛，無腹脹、腹瀉、惡心、嘔吐、發熱及惡寒等，入院查體：肺部聽診呼吸音粗，雙肺未聞及啰音，腹部無壓痛及反跳痛，余查體陰性。實驗室檢查：血白細胞32.37×109/L，中性粒細胞百分比87.9%，CRP 89.6 mg/L，血清蛋白20.2 g/L，PCT 0.69 ng/mL，血肌酐118 μmol/L；24 h尿蛋白5.874 g，尿白細胞280.5個/μL。入院后患者出現發熱，體溫最高達38℃，我科會診后診斷為NS并發感染，轉入我科進一步治療。10月26日轉入后查胸部CT平掃提示雙肺感染，雙側胸腔積液。NS并發感染可診斷，取淺部痰、尿、血行病原學培養以及肺炎支原體、抗CMV-IgM、CMV、呼吸道病毒、曲霉菌GM抗原等檢測均為陰性，予舒普深經驗性抗感染。31日患者突然出現高熱、寒戰，體溫最高達39.9℃，呼吸氣促，肢體顫動，意識障礙。查體：腦膜刺激征陽性，余病理征未引出。血氣分析提示Ⅰ型呼衰，提示患者感染加重，抗感染方案調整為亞胺培南(1 g，qd)+利奈唑胺(600 mg，q12h)靜脈滴注。完善支氣管鏡及腰椎穿刺，留取肺泡灌洗液及腦脊液行NGS檢測。11月2日腦脊液NGS檢測提示嗜麥芽窄食單胞菌。腦脊液常規：白細胞計數22×106/L，中性粒細胞67%，潘氏蛋白2+；腦脊液生化：氯離子142.9 mmol/L，蛋白1 212 mg/L，墨汁染色陰性。復查胸部CT提示：雙肺感染較前吸收，雙側胸腔積液較前減少。影像學提示肺部感染較前好轉，細菌性腦膜炎可診斷，考慮嗜麥芽窄食單胞菌對亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類抗生素天然耐藥，停用亞胺培南及利奈唑胺，單用舒普深(1.5 g，q12h，靜脈滴注)抗感染治療，后患者體溫漸恢復正常，肢體顫動消失，查體腦膜刺激征陰性，復查腦脊液白細胞正常，維持足療程抗菌藥物治療后，患者病情穩定出院，門診隨診。

2 討論

隱球菌是最常見的機會性侵襲性真菌之一，由于自身免疫疾病、腎功能不全等易感人群增多以及糖皮質激素、免疫抑制劑等使用，隱球菌感染率呈上升趨勢[5]。尤其免疫抑制患者對隱球菌感染的免疫反應更差，臨床癥狀更隱蔽，傳統檢測陽性率偏低[6]。本文中病例1患者感染癥狀及影像學表現無特異性，取痰、血等標本行傳統病原學檢測均為陰性，行肺泡灌洗液NGS檢測明確診斷為肺部隱球菌感染。患者神經系統方面僅存在雙顳部、頸部疼痛癥狀，考慮隱球菌與中樞神經系統有高度親和性，行腦脊液檢測進一步診斷為隱球菌性腦膜炎。隱球菌性腦膜炎是一種極為兇險的中樞神經系統感染性疾病，即使積極治療，病死率仍高達60%[7]。隱球菌抗原檢測的靈敏度和特異度都較高，但是由于臨床表現多樣性及典型癥狀出現延遲性，從而導致隱球菌感染易漏診。有研究[8]表明隱球菌感染漏診率可達27%，且漏診患者90天病死率顯著升高。因此，臨床工作中應加強重視免疫抑制患者隱球菌感染風險及多種病原學檢測診斷技術的應用價值。

嗜麥芽窄食單胞菌是一種機會性病原體，以侵犯肺部最為常見，導致中樞神經系統感染相對少見[9]。目前對嗜麥芽窄食單胞菌腦膜炎的了解來源于世界各地散在病例報道，這些患者在感染之前往往有神經外科手術相關的病史[10]，目前尚無NS患者顱內感染嗜麥芽窄食單胞菌的報道。本文中病例2患者出現意識障礙等神經系統表現，腦脊液傳統病原學檢測陰性，感染致病菌不明，雖然積極給予經驗性抗感染治療，患者病情仍持續進展，甚至危及生命。后行腦脊液NGS檢測明確診斷為嗜麥芽窄食單胞菌感染，經調整抗感染治療方案后患者病情得到控制，并逐漸好轉。

NGS是一種新興的病原體檢測方法，通過對標本中的所有微生物進行測序，能夠同時識別細菌、真菌、病毒等多種致病病原體，避免傳統病原檢測效率低、時間長的缺點，對于混合性感染、疑難重癥感染的檢測具有重要作用[11]。Duan等[12]比較NGS和傳統培養的診斷價值，發現NGS的靈敏度高于傳統檢測方法(67.4% VS 23.6%),差異有統計學意義(P<0.001)。中樞神經系統感染性疾病是神經系統重癥疾病，具有高病死率和致殘率等特點。因病原微生物檢測手段有限，極易延誤診斷及治療[13]。NGS不需要假設潛在感染病原體類型，克服了PCR、培養、免疫標志物等靶向診斷方法的局限性，在檢測新發、少見和診斷困難的病原體上呈現了巨大優勢[14]。

NGS越來越多地應用于臨床實踐，但目前NGS檢測的成本仍顯著高于傳統實驗室檢測方法，因此，對于NS并發輕癥感染性疾病或傳統微生物檢測能夠明確病原體的感染，尚不能作為一線檢測手段[15]。二代測序的優勢在于其能檢測到其他傳統手段無法檢測到的病原體，對于傳統病原學檢測不能明確病原體、規范性經驗抗感染無效的患者，推薦在完善常規病原學檢測同時開展NGS。嚴重感染常存在病原體不明的情況，若感染危及生命，表現為膿毒性休克、血流感染、腦膜炎、嚴重肺炎等，除了傳統檢測方法，建議開展NGS盡快明確病原體[16-17]。研究[18]表明經驗性抗感染不能完全覆蓋病原體，使用NGS之后超過一半的患者需要進行抗菌藥物調整或降級。因此，若傳統病原學檢測的結果不能完全解釋臨床表現的全貌或抗感染治療的反應，懷疑同時存在其他病原體感染，在完善更多檢測技術的同時，專家共識推薦進一步完善NGS檢測[16]。

雖然檢測準確性及時效性較傳統病原微生物檢測技術存在很大優勢，但NGS技術作為新型的病原微生物檢測技術，也面臨許多挑戰，包括價格昂貴，提供檢驗的機構多元而檢測質量良莠不齊，無法對于檢出的致病性病原微生物予以藥敏結果指導等[19]。但是，隨著測序成本的降低及技術的改進，相信NGS在感染性疾病的應用會有更光明的前景。

在NS的診治過程中處理感染相關問題，是臨床醫生面臨的一個挑戰。本文報告NGS技術在2例NS并發感染患者中的成功應用，提示臨床醫生應關注新型病原檢測技術在免疫低下人群中的應用，特別是對傳統培養陰性的患者標本進行NGS檢測，有助于早期診斷及治療，對原發病的治療及長期預后的改善，具有重要意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。