克雷伯氏菌乙醛脫氫酶基因過表達及產乙醇發酵工藝優化

查 凡，周 柱，張 琴*，陳 振，陳翔宇，胡永安

（安徽工程大學 生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000）

進入21世紀，以石油為主的化工煉制方式已不能滿足全球經濟、社會發展的需求，以可再生資源為基礎的生物基化學品煉制日益興起。乙醇是目前生物煉制領域相對容易實現產業化的重要生物能源產品之一，可作為高辛烷值燃料和燃油增氧劑添加至汽油中使用，不僅能夠提供與汽油相當的化學能，還能提高汽油的抗爆性，降低汽車尾氣排放，被認為是一種極具潛力的化石能源替代品[1]。隨著市場需求的增加，第二代纖維素燃料乙醇在原料成本和政策方面已頗具競爭優勢，因而成為生物能源企業競爭的焦點[2]。

近年來，木質纖維素資源作為一種地球上廣泛存在且可持續利用的生物質資源，以其為原料生產乙醇已成為燃料乙醇領域的研究熱點[3-6]。如何提高過程效率、降低生產成本是關乎纖維素乙醇高效生產的重點，亦是決定其產業化的關鍵。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是用于乙醇發酵的主要微生物菌株，但其不能分解利用纖維素，亦不能有效轉化利用木質纖維素水解液中的木糖[7-8]，使其在纖維素燃料乙醇生產中不具優勢。

乙醛脫氫酶是乙醇代謝途徑中的關鍵酶，在真核生物（如人、酵母菌）中，乙醛脫氫酶是催化乙醇降解的關鍵酶[9-10]。然而，在原核生物中，乙醛脫氫酶在不同的物種中發揮不同的功能，有研究表明，乙醛脫氫酶可催化芽孢桿菌（Bacillussp.）中乙酸的合成[11]；而在具有混合酸發酵途徑的兼性厭氧細菌，如大腸桿菌（Escherichia coli）、克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）中，乙醛脫氫酶主要催化乙酸和乙醇合成的代謝支路，對乙醇的合成亦起到一定的促進作用[12-15]；HONG W K等[16]在多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）中表達了來自運動發酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶和乙醛脫氫酶基因，使得乙醇產量較之野生菌株提高3.3倍；MANOW R等[17]在產乙醇大腸桿菌RM10中表達了乙醛脫氫酶基因aldB，使其發酵木糖的乙醇產量明顯提高。本研究中的克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）WL1316為一株具備混合酸發酵途徑的兼性厭氧細菌，已報道能利用木質纖維素水解液中葡萄糖和木糖合成生物氫[18-20]，在其發酵產氫過程中，乙醇亦有較高的積累量[19-20]。

為此，本研究基于克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）WL1316的全基因組信息[21]，擬通過同源過表達其乙醇合成途徑中的關鍵酶—乙醛脫氫酶基因aldh，實現該菌株乙醇合成代謝途徑的強化，獲得既能有效利用木質纖維素水解糖液又能高效合成乙醇的工程菌株，并通過單因素試驗及響應面試驗對重組菌株發酵產乙醇的工藝條件進行優化，以期獲得高產乙醇的重組菌株及其最優發酵工藝，對纖維素乙醇的高效廉價開發具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質粒和引物

克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）WL1316、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、原核表達質粒pET-28a均為本實驗室保藏。試驗中用于乙醛脫氫酶aldh基因克隆和亞克隆的引物見表1，引物的合成和后續的基因測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 用于aldh基因克隆和亞克隆的引物及序列Table 1 Primers and sequences for aldh gene cloning and subcloning

1.1.2 試劑

NotI、XhoI限制性核酸內切酶、T4脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接酶、DL5 000 DNA Marker：寶日醫生物技術（北京）有限公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒、質粒小量抽提試劑盒、T載體聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物克隆試劑盒、TaqPCR Master Mix、PCR產物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、TureColor雙色預染蛋白Marker、細菌總蛋白提取試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；K-ETOH乙醇檢測試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

LB液體培養基[17]：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。LB固體培養基中添加瓊脂20 g。

活化和種子培養基[19-20]：D-木糖10 g，葡萄糖10 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 1 g，pH7.5，蒸餾水1 000 mL，110 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

發酵培養基[16-17]：稻草水解液（初始還原糖質量濃度50 g/L）1 000 mL，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）1 mmol/L，pH值7.5，110 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

T100梯度PCR儀、SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統、PowerPac電泳儀：美國Bio-Rad公司；Microfuge 20R高速冷凍離心機：美國貝克曼公司；754PC紫外可見分光光度計：上海菁華儀器有限公司；Scientz IID超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-100C恒溫金屬浴：上海一恒科學儀器有限公司；MultiskanTMFC酶標儀、酶標板：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1Klebsiellasp.WL1316乙醛脫氫酶aldh基因的克隆和亞克隆

作為具有混合酸發酵途徑的兼性厭氧細菌，乙醛脫氫酶為調控Klebsiellasp.WL1316合成乙酸和乙醇代謝支路的關鍵酶[21]，該菌株已進行全基因組測序[21]，且其基因組數據已提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的SRA（sequence read archive）數據庫并獲得BioProject登錄號PRJNA611005。為此，基于該菌株基因組數據的功能蛋白預測和基因注釋，針對乙醛脫氫酶大亞基基因進行引物設計，并命名該基因為乙醛脫氫酶aldh基因。

采用細菌基因組DNA抽提純化試劑盒提取克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）WL1316的基因組DNA，以此作為模板，采用引物對ALF1/ALR1 PCR擴增aldh基因，用PCR產物純化試劑盒純化目的基因，連接pUCm-T載體，并轉化至大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態細胞，再涂布于含20 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃條件下培養14 h。獲得的轉化子進一步進行PCR驗證，并進行測序驗證，測序正確的即為所需陽性克隆。采用引物對ALF12/ALR12 PCR擴增含NotI、XhoI酶切位點的aldh基因，實現aldh基因的亞克隆，連接pUCm-T載體，按上述方法轉化大腸桿菌（Es-cherichia coli）DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，并進行測序驗證，獲得正確的克隆子aldh-pUCm-T-Escherichia coliDH5α。

1.3.2 重組質粒aldh-pET-28a的構建、轉化及驗證

從aldh-pUCm-T-Escherichia coliDH5α中提取aldhpUCm-T克隆質粒，采用NotI/XhoI進行雙酶切并純化目的基因，與同樣雙酶切且純化的pET-28a載體連接，構建重組質粒aldh-pET-28a，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，將其涂布于含10 μg/mL卡那霉素的LB平板，37 ℃條件下培養14 h，篩選陽性轉化子。通過菌液PCR得到重組表達質粒并進行雙酶切，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產物進行檢測，獲得正確的轉化子aldh-pET-28a-Escherichia coliDH5α。

1.3.3 過表達aldh基因重組菌株的構建

從構建成功的aldh-pET-28a-Escherichia coliDH5α中提取重組質粒aldh-pET-28a，采用CaCl2法將該重組質粒轉化至Klebsiellasp.WL1316感受態細胞，涂布含10 μg/mL卡那霉素的LB平板，37 ℃條件下培養14 h，獲得轉化子，并抽提質粒，再進行雙酶切和測序驗證，驗證正確的菌株即為研究所得的重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316。

1.3.4 目的蛋白誘導表達和SDS-PAGE電泳檢測

將過表達aldh基因的重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316和野生菌Klebsiellasp.WL1316分別接種于LB固體培養基（重組菌的培養基中加10μg/mL卡那霉素），37℃條件下活化16 h；挑單菌落接種于10 mL LB液體培養基（重組菌的培養基中加10 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、180 r/min條件下培養過夜；取培養好的菌液5mL接種于新鮮的100 mL LB液體培養基（重組菌的培養基中加10 μg/mL卡那霉素）中，野生菌在37 ℃、180 r/min條件下培養8 h；重組菌在37 ℃、180 r/min條件下培養2 h時，在重組菌發酵液中加入無菌的IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃、180 r/min條件下繼續誘導培養6 h。取20 mL菌液8 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體，采用細菌總蛋白提取試劑盒提取菌體中的總蛋白；采用SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒對蛋白質進行檢測。

1.3.5 過表達aldh基因重組菌株發酵稻草水解液產乙醇過程的研究

挑取活化好的野生菌Klebsiellasp.WL1316和過表達aldh基因重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316的單菌落，分別接種于3 mL種子培養基（重組菌的培養基中加10 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、180 r/min條件下培養12～14 h作為一級種子液；按10%（V/V）的接種量將一級種子液接種于30 mL種子培養基（重組菌的培養基中加10 μg/mL卡那霉素）中，野生菌在37 ℃、180 r/min條件下培養8 h，作為二級種子液；重組菌在37 ℃、180 r/min條件下培養2 h時，加入無菌的IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃、180 r/min條件下繼續誘導培養6 h，作為二級種子液。將二級種子液按10%（V/V）的接種量接入發酵培養基，37 ℃、180 r/min條件下培養12 h，之后轉入第二段厭氧發酵，37 ℃靜置發酵至72 h。每12 h取發酵液，8 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液，采用K-ETOH乙醇檢測試劑盒檢測乙醇含量，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[22]檢測葡萄糖含量，采用地衣酚比色法[23]檢測木糖含量，并計算葡萄糖和木糖利用率，其計算公式如下：

1.3.6 過表達aldh基因重組菌株發酵稻草水解液產乙醇工藝優化

單因素試驗：按照1.3.5的方法依次考察IPTG濃度（0、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L）、發酵培養基初始pH值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）和初始還原糖含量（25 g/L、50 g/L、75 g/L、100 g/L）對乙醇產量的影響。

響應面試驗：在單因素試驗的基礎上，以乙醇產量（Y）為響應值，以IPTG濃度（A）、初始pH值（B）及初始還原糖含量（C）為考察因素，采用Design-Expert 12.0軟件設計3因素3水平的響應面試驗，試驗因素與水平見表2。

表2 過表達aldh基因重組菌株發酵稻草水解液產乙醇工藝優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for process optimization of ethanol production from rice straw hydrolysate by gene recombinant strain of overexpressing aldh gene

2 結果與分析

2.1 Klebsiella sp.WL1316乙醛脫氫酶基因aldh的克隆和亞克隆

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對aldh基因克隆和亞克隆的PCR擴增產物進行檢測，結果見圖1。由圖1可知，PCR擴增產物堿基長度均約為1 000 bp，與預期目標條帶大小相符，表明獲得了這個基因的克隆和亞克隆產物。克隆和亞克隆PCR擴增產物與pUCm-T載體連接，并轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，進一步篩選獲得的陽性克隆，進行測序驗證，結果表明，該aldh基因序列與肺炎克雷伯菌（Kleb siella pneumoniae）（GenBank登錄號：WP_117070081.8）的乙醛脫氫酶基因序列的一致性達100%，并與Klebsiellasp.WL1316的基因組解析結果完全一致，說明克隆獲得了序列正確的aldh基因。

圖1 aldh基因克隆（a）和亞克隆（b）PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of aldh gene clones (a) and subclones (b)

2.2 過表達aldh基因重組菌株的構建

提取陽性克隆的aldh-pUCm-T質粒，雙酶切并純化目的基因，與同樣雙酶切的pET-28a載體連接、轉化、篩選，獲得重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316。提取重組表達質粒aldh-pET-28a，采用NotI/XhoI進行雙酶切，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產物進行檢測，結果見圖2。

圖2 重組表達質粒aldh-pET-28a雙酶切產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.2 Determination results of agarose gel electrophoresis of double digestion products of recombinant expression plasmid aldh-pET-28a

由圖2可知，獲得了堿基長度正確的目的條帶，表明得到正確的重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316。

2.3 aldh基因的同源過表達

重組菌株通過IPTG誘導表達，采用SDS-PAGE檢測目的蛋白，結果見圖3。

圖3 目的蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoretic diagram of target protein

理論上，aldh基因序列翻譯后的目的蛋白分子質量應該為32.8 kDa，由圖3可知，在分子質量接近35 kDa處出現了條帶，并較之野生菌有一定加深，初步表明該乙醛脫氫酶基因在Klebsiellasp.WL1316中實現了同源過表達。

2.4 重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiella sp.WL1316發酵稻草水解液產乙醇過程的研究

有研究表明，乙醛脫氫酶表達量越高，乙醇產量越高[17]。為研究aldh基因表達對菌株乙醇合成及稻草水解液中葡萄糖和木糖的利用動態，本研究對重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316和野生菌Klebsiellasp.WL1316發酵72 h內的乙醇產量及葡萄糖和木糖利用率的動態變化進行監測，結果見圖4。由圖4A可知，在菌株發酵過程中，乙醇呈動態積累的趨勢，可能是由于菌株中存在不同功能乙醛脫氫酶，使得菌株乙醇產量在一定發酵階段達到峰值。當重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316發酵至60 h時，乙醇產量達到最高，為（4.92±0.03）g/L，較野生菌Klebsiellasp.WL1316提高18.3%，可推測菌株中過表達aldh基因有利于乙醇在60 h的積累，為此，選擇60 h為適宜的發酵時間。由圖4B亦可知，重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316的葡萄糖和木糖利用率和野生菌Klebsiellasp.WL1316的無顯著差異（P＜0.05），由此可認為，重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316保持了野生菌Klebsiellasp.WL1316利用木質纖維素水解液中葡萄糖和木糖的能力，aldh基因的表達并未降低其糖利用效率。

圖4 重組菌和野生菌的乙醇產量（A）和還原糖利用率（B）Fig.4 Ethanol production (A) and reducing sugar utilization rate (B)of recombinant strain and wild strain

2.5 過表達aldh基因重組菌株發酵稻草水解液產乙醇工藝優化

2.5.1 單因素試驗

IPTG濃度、發酵培養基初始pH值和初始還原糖含量對重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316發酵稻草水解液生產乙醇的影響見圖5。

圖5 IPTG濃度（A）、初始pH值（B）及初始還原糖含量（C）對重組菌株發酵稻草水解液產乙醇的影響Fig.5 Effects of IPTG concentration (A),initial pH (B) and initial reducing sugar content (C) on ethanol production from rice straw hydrolysate fermented by recombinant strain

在原核基因表達過程中，誘導劑能夠提高重組蛋白的整體表達量[17]。由圖5A可知，IPTG誘導濃度在0.5～2.0 mmol/L范圍內，乙醇產量較未誘導菌株的均顯著提高（P＜0.05），尤以1.0 mmol/L的誘導菌株效果最好，其乙醇產量可達（4.90±0.05）g/L，較未誘導的提高35.00%。因此，選擇IPTG最佳誘導濃度為1.0 mmol/L。

由圖5B可知，在1.0 mmol/L IPTG誘導下，重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316在初始pH6.5～8.5的范圍內均能有效地合成乙醇，乙醇產量呈先升高后下降的趨勢，當初始pH值為7.5時，乙醇產量最高，為（4.92±0.03）g/L。因此，選擇pH7.5為最適宜的發酵初始pH值。

由圖5C可知，在IPTG誘導濃度和發酵初始pH值固定為1.0 mmol/L和7.50條件下，重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316在初始還原糖含量為25～100 g/L范圍內，乙醇產量呈先升高后下降的趨勢，分析原因可能是初始還原糖含量較低可能引起碳源不足，但初始還原糖含量過高又會對乙醇的積累起到一定的抑制作用。當初始還原糖含量為50 g/L時，乙醇產量最高，為（4.99±0.59）g/L。因此，選擇50 g/L為最佳的初始還原糖含量。

2.5.2 響應面試驗

響應面試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert 12.0軟件對表3結果進行二次回歸分析，得重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316乙醇含量的二次多元回歸方程如下：

由表4可知，模型顯著（P＜0.05），而失擬項不顯著（P＞0.05），表明建立的模型擬合程度良好。決定系數R2可對模型的精確性和變異性進行評估[24-25]，本模型的R2為0.853 7，表明實測值和預測值之間呈較顯著的相關關系，響應值的大多數變化都能通過模型進行預測。由表4亦可知，二次項C2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項B和二次項B2對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

采用Design-Expert 12.0軟件對回歸方程進行求解，得到重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316發酵稻草水解液產乙醇的最佳工藝條件為：IPTG誘導濃度1.45 mmol/L，初始pH值7.29，初始還原糖含量59.10 g/L，乙醇產量理論值為5.11 g/L。為便于實際操作，將最優發酵工藝修正為IPTG濃度1.5 mmol/L，初始pH值7.3，初始還原糖含量59 g/L，采用最優發酵工藝得到重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316的乙醇產量實際值為（5.39±0.51）g/L，與理論值接近，是同等發酵條件下野生菌Klebsiellasp.WL1316乙醇產量[（3.67±0.32）g/L]的1.47倍，可見aldh基因的過表達促進了乙醇產量的提高，這與OH B R等[26]報道的在肺炎克雷伯氏菌中過表達乙醛/乙醇脫氫酶AdhE基因的促乙醇合成效果類似，由此也證明了本研究基因操作策略的可行性。

3 結論

本研究成功構建了同源過表達aldh基因的重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316，其發酵稻草水解液60 h時的乙醇含量較野生菌株提高18.3%，并保持了野生菌株利用木質纖維素水解液中葡萄糖和木糖的特性，這對于纖維素乙醇的生產至關重要。通過單因素和響應面試驗得到重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316發酵稻草水解液產乙醇的最優發酵工藝條件為：發酵時間60 h，IPTG濃度1.5 mmol/L，發酵培養基初始pH值7.3，初始還原糖含量59 g/L，在此最優工藝條件下，乙醇產量為（5.39±0.51）g/L，較同等發酵條件下野生菌株Klebsiellasp.WL1316的乙醇產量[（3.67±0.32）g/L]提高47%。可見，本研究對纖維素乙醇發酵生產基因重組菌株的研發及乙醇燃料的高效廉價開發具有重要的理論和實踐意義。