桑葚酵素發酵過程中理化指標及抗氧化活性的變化

王 帥，宋 奇，范 影，馮 超

（安徽新天生物科技有限公司，安徽 阜陽 236600）

桑葚（Fructus mori），又名桑椹子，為桑科植物桑樹的成熟果穗，大多為紅紫色或黑色橢圓型聚花果，甜酸清香，營養成分豐富[1]。桑葚富含粗纖維、游離酸、氨基酸以及人體所必需的礦物質和微量元素，此外，還含有維生素、酚類化合物、花青素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多種生物活性物質，桑葚也是醫療保健價值較高的一種“藥食同源”農產品[2-4]。中醫認為，桑葚味甘酸、性寒，入肺、肝、腎、大腸經，具有補肝益腎、滋陰補血、降壓消渴、美容養顏等功效[5]。現代醫學研究也表明：桑葚中的脂肪酸具有分解脂肪、降低血脂，防止血管硬化等作用，桑葚中含有的抗氧化和生物活性成分，具有延緩衰老、增強免疫力、防癌抗癌、明目等功效[6]。

食用酵素是以新鮮的蔬菜、水果、藥食同源中藥等為原料，破碎、榨汁、萃取等一系列工藝處理后，經過微生物發酵所產生的含有豐富的營養成分以及生物活性物質的發酵液[7]。它不僅保留了原料中原有的多種維生素、氨基酸、酚類、多糖等功效成分，還通過微生物發酵過程中的代謝作用將不易被人體所吸收的大分子物質轉化成更易于被人體所吸收和利用的小分子物質，此外，還產生新的生物活性成分，大大提高了酵素的營養價值[8-9]。近年來，國內外諸多學者對沙棘酵素[10]、蘋果酵素[11]、枇杷酵素[12]、銀耳藍莓酵素[13]等發酵過程中理化性質及抗氧化活性進行了深入的研究，對相關酵素生產過程的控制起到重要的指導意義。

本實驗以桑葚酵素為研究對象，通過桑葚酵素發酵過程中理化指標及生物活性物質的測定，研究了pH、總酸、總酚等含量的變化趨勢，并測定了發酵過程中2,2'-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）自由基清除能力、超氧化物歧化酶（SOD）活性等抗氧化能力的變化情況。采用Pearson相關系數法進行相關性分析，初步探究了抗氧化活性與理化指標、活性物質等的相關性，為桑葚酵素的發酵過程中的精準控制提供相關數據理論支持，同時，也對桑葚酵素的保健功能機理的研究及其綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮桑葚果實：采摘于安徽太和縣桑葚果園；白砂糖（食品級）：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）：中國工業微生物菌種保藏管理中心。NaOH、雙縮脲試劑（均為分析純）：廣州和為醫藥科技有限公司；SOD活性檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、硫酸、苯酚、ABTS（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酸性氧化電位水、純化水：安徽新天生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；TG16G臺式離心機：常州金壇良友儀器有限公司；752N紫外分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；2WAJ阿貝折射儀：上海光學儀器一廠；YP502N電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海雷磁儀器有限公司；SCPJ-10錘式破碎輸送機：靖江艾莉特食品機械有限公司；50 L發酵罐：安徽神健化工醫藥裝備股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚酵素的制備

新鮮桑葚用酸性氧化電位水、純化水沖洗后，自然瀝干，打漿，將桑葚果漿與白砂糖按料液比10∶1（g∶mL）加入酵素發酵罐中，再加入1%調配好的菌液（釀酒酵母∶醋化醋桿菌∶嗜熱鏈球菌體積比為0.2∶0.4∶0.4），攪拌均勻后，于20～25 ℃條件下避光發酵49 d。每隔7 d攪拌一次，每次攪拌10 min，攪拌結束后，取樣，10 000 r/min離心5 min，棄沉淀，上清液即為桑葚酵素，放置在-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2 分析檢測

pH的測定：采用PHS-3C pH計；總酸含量的測定：參照國標GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》；可溶性固形物含量的測定：采用阿貝折射儀[14]；蛋白質含量的測定：采用雙縮脲試劑法[15]；總糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法[16]；總酚含量的測定：采用Folin-Ciocalteus法[17-18]；超氧化物歧化酶（SOD）活性的檢測：SOD活性檢測試劑盒[19-20]。

ABTS自由基清除能力的測定：參照張浩然等[10]的方法制備ABTS自由基稀釋液，取7.5 μL樣品，用5 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH7.4）補充至300 μL，加入5 mL ABTS自由基稀釋液，30 ℃條件下反應1 h，在波長734 nm處測定吸光度值。計算ABTS自由基清除率，其計算公式如下[21]：

式中：A1是空白管的吸光度值，A2是為樣品測定管的吸光度值，A3為對照管的吸光度值。

1.3.3 理化指標與抗氧化指標相關性分析

采用Pearson相關系數法利用SPSS 22.0軟件進行理化指標與抗氧化指標的相關性分析。

1.3.4 數據處理

實驗數據均以“平均值±標準差”（n≥3）表示，采用Origin 2017軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 桑葚酵素發酵過程中pH和總酸含量的變化

pH和總酸含量是判斷發酵是否正常和衡量發酵液品質的主要理化指標[7]。桑葚酵素發酵過程中pH值和總酸含量的變化見圖1。由圖1可知，在整個發酵過程中，pH值和總酸含量的變化趨勢是相反的，pH隨著發酵時間的延長而不斷降低，而總酸含量則不斷升高，直至發酵結束，發酵液中pH值和總酸含量都趨于穩定，不再發生變化。在發酵前42 d，總酸含量呈現顯著的增長，這主要是由于在該發酵階段，醋化醋桿菌、嗜熱鏈球菌等微生物快速繁殖，產生乳酸、醋酸等多種代謝產物導致pH持續降低，總酸含量的不斷增長[22]。42 d至發酵結束，pH穩定在3.60，總酸含量穩定在6.65 mg/mL，隨后總酸含量出現輕微下降，pH升高至3.65，這可能是由于在發酵后期，較低的pH影響到微生物的總酸代謝積累，且微生物降解了一部分有機酸，導致總酸含量略有下降。

圖1 桑葚酵素發酵過程中pH及總酸含量的變化Fig.1 Changes of pH and total acid contents in the fermentation process of mulberry Jiaosu

2.2 桑葚酵素發酵過程中可溶性固形物和蛋白質含量的變化

桑葚酵素發酵過程中，可溶性固形物和蛋白質含量可較為直觀反映發酵液品質，其含量隨發酵時間的變化見圖2[23]。

圖2 桑葚酵素發酵過程中可溶性固形物及蛋白質含量的變化Fig.2 Changes of soluble solids and protein contents in the fermentation process of mulberry Jiaosu

由圖2可知，發酵前7 d可溶性固形物含量迅速下降，蛋白質含量呈現增長的趨勢，該階段營養成分充足，微生物迅速繁殖，大量的消耗利用糖類等可溶性的營養物質，產生代謝產物蛋白質和少量的酶類，使可溶性固形物含量迅速下降，7 d至發酵結束，可溶性固形物呈現先稍微上升隨后下降并趨于穩定的趨勢，而蛋白質含量呈現先下降后上升最終趨于穩定的趨勢，這可能是微生物為維持生命活動，開始將桑葚發酵液中蛋白質等物質轉化為可溶性碳水化合物并被逐漸利用，同時，不斷代謝產生蛋白質、酶等代謝產物，使蛋白質含量呈現增長趨勢，至發酵結束（49 d），蛋白質含量基本穩定在31.85mg/g，可溶性固形物含量穩定在6.00%。

2.3 桑葚酵素發酵過程中總糖含量的變化

糖作為微生物發酵過程中的主要碳源，其含量變化反映微生物的生長和代謝情況[24]。桑葚酵素發酵過程中總糖含量的變化見圖3。

圖3 桑葚酵素發酵過程中總糖含量的變化Fig.3 Changes of total sugar contents in the fermentation process of mulberry Jiaosu

由圖3可知，發酵前14 d，總糖含量出現顯著下降的趨勢，這可能是有由于此階段微生物進入快速生長期，糖類物質主要被釀酒酵母、醋化醋桿菌、嗜熱鏈球菌等微生物用于增殖和代謝，發酵至14 d，總糖含量達到4.73 mg/mL，發酵第14天至發酵結束，總糖含量有緩慢增加的趨勢，并逐漸趨于穩定在6.85 mg/mL。這可能是由于微生物的大量生長和繁殖，分解了桑葚的營養物質，生成了糖類代謝產物，使發酵液的總糖含量升高，當微生物消耗的總糖與糖類代謝產物的產生量趨于平衡時，發酵液中的總糖含量基本處于穩定狀態，發酵結束。

2.4 桑葚酵素發酵過程中總酚含量的變化

作為優良的天然抗氧化物質，酚類化合物具有抗氧化、延緩衰老、消炎等功能特性[25]。桑葚酵素發酵過程中總酚含量的變化見圖4。由圖4可知，發酵前7 d，總酚含量上升較慢，這可能是由于處于發酵前期的桑葚在高滲透壓作用下多酚類物質的溶出所致。7～42 d總酚含量快速上升，在42 d時達到最大值1.61 mg/mL，這可能是由于微生物大量繁殖，代謝較為迅速，產生大量的酚類次生代謝產物；總酚含量的上升會對微生物的生長起到一定的抑制作用，此時，發酵液中的優勢菌群為了維持自身的正常生命活動，一些多酚氧化酶被活化，促進酚類物質轉化成其他代謝產物，從而導致在發酵后期桑葚酵素的總酚含量出現稍微下降的現象。

圖4 桑葚酵素發酵過程中總酚含量的變化Fig.4 Changes of total phenol contents in the fermentation process of mulberry Jiaosu

2.5 桑葚酵素發酵過程中ABTS自由基清除率的變化

ABTS自由基是一種穩定存在的自由基，其清除能力是評價親水性和親脂性物質的抗氧化能力的指標之一[26]。桑葚酵素發酵過程中ABTS自由基的清除率變化見圖5。由圖5可知，發酵過程中ABTS自由基清除率呈現先上升后趨于穩定的趨勢，從發酵開始23.46%的清除率上升至42 d時的69.86%的清除率，隨后，逐漸趨于穩定，整個發酵過程桑葚酵素的ABTS自由基清除率增長了約3倍。研究表明，酚類化合物、有機酸等化合物與ABTS自由基清除率存在著密切的關系，這也可能是使桑葚酵素發酵液的ABTS自由基清除率逐漸增高并最終趨于穩定的主要因素[27]。

圖5 桑葚酵素發酵過程中ABTS自由基清除能力的變化Fig.5 Changes of ABTS free radical scavenging rates in the fermentation process of mulberry Jiaosu

2.6 桑葚酵素發酵過程中超氧化物歧化酶活性的變化

超氧化物歧化酶廣泛分布在微生物體內，是生物體系中抗氧化酶系的重要組成部分，具有延緩皮膚衰老、免疫調節、抗氧化等功能[28]。桑葚酵素發酵過程中SOD活性的變化見圖6。由圖6可知，SOD活性隨著發酵時間的延長呈逐漸增加趨勢，發酵35 d后緩慢增加并趨于穩定，發酵結束時SOD活性從發酵初期的12.75 U/mL增至93.35 U/mL。說明桑葚經過微生物發酵所產生的代謝產物中含有超氧化物歧化酶或能提高超氧化物歧化酶活力的活性物質，這可能也是桑葚酵素具有較強自由基清除能力的重要原因之一。

圖6 桑葚酵素發酵過程中超氧化物歧化酶活性的變化Fig.6 Changes of superoxide dismutase activities in the fermentation process of mulberry Jiaosu

2.7 桑葚酵素發酵過程中各指標之間相關性分析

在不同的發酵過程中，桑葚酵素ABTS自由基清除率、SOD活性這兩個抗氧化指標具有明顯的差異性，這可能與桑葚酵素中的pH、可溶性固形物、總酸、總糖、總酚等有關，對發酵過程中上述參數與ABTS自由基清除率、SOD活性進行Pearson相關性分析，結果見表1。

表1 桑葚酵素發酵過程中各參數相關性分析結果Table 1 Correlation analysis results of various parameters in the fermentation process of mulberry Jiaosu

由表1可知，ABTS自由基清除率和SOD活性這兩個抗氧化指標之間存在極顯著的正相關性（P＜0.01），總酸、蛋白質和總酚與兩個抗氧化指標之間呈現極顯著的正相關（P＜0.01），而pH、可溶性固形物、總糖與抗氧化指標之間呈現顯著的負相關（P＜0.05）。結果表明，在發酵過程中，微生物所產生的有機酸、酚類化合物、蛋白質等代謝產物具有一定的抗氧化作用，而糖類物質在微生物發酵過程中被消耗代謝產生有機酸、酚類化合物等活性物質，進而提高其抗氧化能力。

3 結論

本實驗重點研究了桑葚酵素自然發酵過程中理化指標、代謝物含量及抗氧化活性的變化，并對各個指標之間的相關性進行了分析。結果表明，在整個發酵過程中，pH呈不斷下降的趨勢，至發酵結束時，pH在3.65左右趨于穩定，總酸含量的變化則與pH相反，發酵結束時總酸含量為6.65 mg/mL。總糖和可溶性固形物呈現相同的先快速下降后略有上升，最后趨于穩定的趨勢。總酚含量、ABTS自由基清除率和SOD活性的變化趨勢基本相同，呈現先上升后趨于穩定的趨勢，這也說明了微生物發酵過程有生物活性成分的產生，提升了桑葚酵素的抗氧化能力。通過相關性分析，也進一步說明了抗氧化活性的提高與總酸、蛋白質和總酚含量的變化呈現極顯著的相關性（P＜0.01）。通過對桑葚酵素發酵過程中理化指標和代謝產物含量變化的研究，能較為直觀的反映出發酵進程和生物活性物質的累積情況，為桑葚酵素的研究提供一定的數據支持，也為桑葚酵素系列產品的推廣提供了一定的理論基礎。