高酸價肉油在傳統泡酒過程中的脂質氧化及風味成分變化

梁詩雅，張鳳嬌，何松貴，關菁怡，黎偉剛，吳振強*

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山 528200）

豉香型白酒因其獨特的脂肪風味而廣受歡迎，尤其是在中國南方地區[1]。豉香型白酒采用大米為原料，經蒸煮后拌入大酒餅，邊糖化邊發酵，發酵后的醪液經釜式蒸餾后得乙醇體積分數為28%～38%的低度白酒，俗稱“齋酒”，具有酒體渾濁、味道辛辣的特點[2]，需經過陳肉醞浸后形成豉香風味，最后經過陳釀、勾兌、過濾后得到成品酒[3]。陳肉醞浸是豉香型白酒的關鍵工序，是典型風格形成的必要工序，它能夠通過提供醛和酸等物質豐富基酒的成分，并通過提供辛醛和壬醛等物質形成強烈的脂肪香氣[1，4]。陳肉在生產過程中發生緩慢而復雜的脂質氧化變化，但操作較為繁瑣且耗時，難以滿足日益增長的市場需求，因此，需要加速陳肉的生產。

陳肉具有高酸價（acid value，AV）和高氧化水平的特點。到目前為止，已研究了光照、過氧化氫、脂肪氧合酶等對泡酒肥肉的加速氧化作用，但是都未能有效提高其酸價[5]。其中，在齋酒內加入適量取自陳肉浸泡過程中逸出的具有高酸價的肥油，共同浸泡使肥肉的酸價提高，然而這并不能根本意義上促進脂質氧化，而是一種傳質作用[6]。

脂肪酶能催化甘油三酯水解生成甘油和游離脂肪酸。有研究報道，在多種食品系統中，油脂水解過程可以促進油脂氧化[7]。國內有研究者分別在羊肉發酵香腸[8]、臘鴨腿[9]中加入脂肪酶，發現適量地添加外源脂肪酶能加速腌臘肉制品脂肪酸的分解，從而加速脂質氧化。為了提高肉油的酸價和脂肪酶的利用效率，本研究采用包埋法固定脂肪酶，通過固定化脂肪酶的水解作用提高肉油自身的酸價，獲得高酸價的肉油，并進一步研究高酸價肉油在傳統泡酒工藝下的脂質氧化和風味變化，以期為替代傳統工藝提出高效、簡單的潛在途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取自豬肩背部的新鮮肥豬肉（約5 cm×5 cm×5 cm，質量約50 g）、齋酒（酒精度為55%vol）：廣東省九江酒廠有限公司；脂肪酶（10萬U/g）：上海麥克林生化科技有限公司；37種脂肪酸甲酯標準品（均為色譜純）：Sigma-Adrich（上海）貿易有限公司；明膠、海藻酸鈉（均為生化試劑）、正己烷、甲醇、鄰二氯苯（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HH-S恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司；C21-WT2118電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司；JS39D-250絞肉機：浙江紹興蘇泊爾家居用品有限公司；ZWYD-2402恒溫培養振蕩器（搖床）：智誠分析儀器制造有限公司；FJ200-SH高速分散均質機：上海滬析實業有限公司；UV-2802S型紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；GC-2014C氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、Wondacap-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：島津（中國）有限公司；PDMS/DVB/CAR固相微萃取探針：青島貞正分析儀器有限公司；7000C頂空進樣氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀、HP-5ms Ultra Inert色譜柱（15 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化脂肪酶的制備

準確稱取海藻酸鈉1.5 g，明膠1.5 g于燒杯中，混合后加入50 mL去離子水，于80 ℃水浴加熱并攪拌，充分溶解后冷卻至室溫，再于100 r/min條件下加入100 mg脂肪酶直至充分混勻。用10 mL注射器將上述溶液逐滴加入4%的氯化鈣溶液中，于4 ℃固化2 h。過濾后取酶制劑凝珠，用去離子水洗滌3次，抽濾，于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 高酸價肉油的制備

新鮮的肥豬肉在50 ℃溫水中浸泡40 min，然后在沸水中煮15 min，煮熟的肥豬肉在絞肉機中絞碎，用雙層紗布過濾后得到普通肉油。將普通肉油與固定化脂肪酶按質量比50∶3于30 ℃、120 r/min條件下反應20 h，作為加酶組，每4 h取樣測其酸價。取最佳處理時間的肉油經雙層紗布過濾除去固定化脂肪酶，再于95 ℃水浴加熱去除肉油中可能殘留的酶活，得到高酸價肉油。未經固定化脂肪酶水解的普通肉油也執行上述操作，作為對照組。

1.3.3 高酸價肉油的傳統泡酒實驗

以未經固定化脂肪酶水解的普通肉油為對照組，將獲得的高酸價肉油與酒精度為55%vol的齋酒以料液比1.0∶2.5（g∶mL）加入密封罐中，于25 ℃的黑暗處靜置浸泡60 d，每15 d取樣檢測其酸價、過氧化值、茴香胺值和脂肪酸組成，60 d后取樣檢測其揮發性化合物組成。

1.3.4 高酸價肉油的脂質氧化分析

油脂脂質氧化常用的評價指標包括酸價（AV）、過氧化值（peroxide value，PV）、茴香胺值（anisidine value，AnV）。將肉油與石油醚（沸程30～60 ℃）按料液比1∶1（g∶mL）混合后，靜置提取24 h。經裝有無水硫酸鈉的漏斗過濾，取濾液，在低于40 ℃的水浴中，用旋轉蒸發儀減壓蒸干石油醚，殘留物即為待測樣品。酸價的測定參照國標GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》[10]。過氧化值的測定參照GB5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[11]。茴香胺值的測定參照國標GB/T 24304—2009《動植物油脂茴香胺值的測定》[12]。

1.3.5 高酸價肉油的脂肪酸組成分析

通過對BHOURI A M等[13]所報道的方法稍作調整，使用GC測定肉油的長鏈脂肪酸組成。準確稱取約0.02 g待測樣品，加入2 mL正己烷，充分振搖至其溶解，然后加入4 mL 2 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，渦旋3 min，使待測樣品中的脂肪酸完全甲酯化。靜置后，取上層液體并用正己烷稀釋10倍，然后經0.22 μm有機濾膜過濾后用于氣相色譜分析。

氣相色譜條件：Wondacap-Wax熔融石英毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）；載氣為氮氣（N2）；流速1.5 mL/min；進樣量1 μL；進樣口與檢測器溫度250 ℃；分流比1∶2；升溫程序為在160 ℃保持3 min，再以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，最后以2 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持3 min。

定性、定量方法：通過脂肪酸甲酯化標準品的保留時間對待測樣品中的脂肪酸進行定性，通過外標法進行定量。

1.3.6 高酸價肉油的揮發性化合物測定

參照WEN R X等[14]的方法采用固相微萃取-氣相色譜-質譜法（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）測定肉油的揮發性化合物。

1.3.7 數據分析

采用軟件Origin 8.5進行繪圖，采用SPSS 17.0單因素分析方法進行數據分析，所有實驗平行進行3次，最終結果均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 固定化脂肪酶處理肉油酸價的變化

普通肉油及固定化脂肪酶處理肉油過程中酸價的變化見圖1。由圖1可知，在加入固定化脂肪酶的肉油中，隨著處理時間的延長，肉油的酸價逐漸上升而后下降；當水解時間為16 h時，酸價最高，達到（26.32±2.01）mg/g。而在對照組的肉油中，隨著時間的延長，肉油的酸價變化緩慢且酸價始終較低，均在0.4 mg/g左右。水解16 h后，加酶組肉油的酸價約是對照組的66倍，即制備得到高酸價肉油。說明脂肪酶促進脂肪水解生成大量脂肪酸，導致酸價上升，從而獲得高酸價肉油。因此，選擇固定化脂肪酶處理肉油時間為16 h。

圖1 普通肉油及固定化脂肪酶處理肉油過程中酸價的變化Fig.1 Changes of acid value of common pork fat pulp and pork fat pulp treated with immobilized lipase

2.2 傳統泡酒過程中高酸價肉油的脂質氧化

2.2.1 酸價的變化

傳統泡酒過程中肉油酸價的變化見圖2。由圖2可知，傳統泡酒過程中（0～60 d），普通肉油（對照組）的酸價由（0.59±0.05）mg/g變為（0.47±0.04）mg/g，期間的酸價只有微小波動，這表明普通肉油（對照組）的水解程度和氧化程度均很低。高酸價肉油浸泡0 d時的酸價[（26.32±2.01）mg/g]顯著高于對照組（P＜0.05），這是因為在脂肪酶的水解作用下，脂肪被水解成脂肪酸；浸泡15 d時，高酸價肉油的酸價降低為（22.47±1.10）mg/g，可能是因為部分脂肪酸被氧化降解為氫過氧化物[15-16]。浸泡15～60 d時，高酸價肉油的酸價逐漸升高，浸泡60 d時，酸價為[（26.73±2.84）mg/g]，可能是因為高酸價肉油的脂質在泡酒過程中仍不斷被水解為脂肪酸[17]，而且部分氧化產物（如醛類、酮類等物質）被進一步氧化為羧酸[18]。

圖2 傳統泡酒過程中肉油酸價的變化Fig.2 Changes of acid value of pork fat pulp during traditional liquor soaking

2.2.2 過氧化值的變化

幾乎所有的油脂氧化過程均會產生氫過氧化物，它是脂質氧化的第一個中間產物，因此過氧化值（PV）可用來評價油脂的氧化程度。傳統泡酒過程中肉油過氧化值的變化見圖3。

圖3 傳統泡酒過程中肉油過氧化值的變化Fig.3 Changes of peroxide value of pork fat pulp during traditional liquor soaking

由圖3可知，肉油的PV均隨浸泡時間的增加而逐漸升高，表明脂肪酸發生氧化，生成氫過氧化物。浸泡0～45 d內，高酸價肉油與對照組普通肉油的PV無顯著性差異（P＞0.05）；浸泡60 d時，高酸價肉油的PV[（4.99±0.34）meq/kg]是浸泡0 d的12.17倍（P＜0.05），比同時期的普通肉油（對照組）顯著提高了32%（P＜0.05）。結果表明，脂肪酶的作用促進了脂肪水解，快速生成脂肪酸，并氧化生成氫過氧化物，這與脂肪酶對火腿片的作用結果一致[15]。

2.2.3 茴香胺值的變化

脂肪酸氧化產生的氫過氧化物極不穩定，容易分解生成次級氧化產物，如α或β不飽和醛，其生成量用茴香胺值（AnV）表示[19]。傳統泡酒過程中肉油茴香胺值的變化見圖4。由圖4可知，高酸價肉油與普通肉油（對照組）的AnV都隨浸泡時間的增加而逐漸升高，且高酸價肉油的AnV高于對照組普通肉油。浸泡0～60 d內，高酸價肉油的AnV升高速度較快且幅度較大；而普通肉油（對照組）的AnV升高速度緩慢且幅度極小。當浸泡時間為60 d時，高酸價肉油的AnV為1.30±0.13，是同時期對照組的5.65倍（P＜0.05）。這表明脂肪酶制備得到的高酸價肉油氧化產生的大量氫過氧化物，進一步分解為醛、酮、酸等低分子物質[12]。

圖4 傳統泡酒過程中肉油茴香胺值的變化Fig.4 Changes of anisidine value of pork fat pulp during traditional liquor soaking

2.3 傳統泡酒過程中高酸價肉油脂肪酸的變化

傳統泡酒過程中高酸價肉油長鏈脂肪酸組成的變化見表1。

由表1可知，浸泡0 d時，高酸價肉油的脂肪酸總量為（58.20±0.18）g/100 g，比普通肉油（對照組）[（55.63±0.95）g/100 g]提高了4.62%；飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）和不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）分別是普通肉油（對照組）的1.07倍和1.01倍，這可能是因為脂肪酶促進肉油脂肪水解并釋放了更多的脂肪酸[20]。浸泡60 d時，高酸價肉油的脂肪酸總量為（51.99±0.16）g/100 g，普通肉油（對照組）的脂肪酸總量為（58.96±0.33）g/100 g，這可能是因為高酸價肉油的脂質氧化速度快于普通肉油（對照組），脂肪酸迅速被氧化降解為氫過氧化物、醛、酮等物質，導致其脂肪酸總量減少[21]。總體而言，高酸價肉油的飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fattyacid，MUFA）、多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）和脂肪酸總量的變化趨勢都與普通肉油（對照組）的變化趨勢一致，其中C16：0、C18：1和C18：0是兩組肉油中含量最豐富的3種脂肪酸，這與李玲芳等[22]的研究結果一致。浸泡60 d時，C16：0、C18：1和C18：0的含量分別占高酸價肉油脂肪酸總量的38.07%、28.54%和17.45%，分別占普通肉油（對照組）脂肪酸總量的35.80%、28.82%和19.30%。

2.4 傳統泡酒過程中高酸價肉油揮發性化合物的變化

通過SPME-GC-MS測定固定化脂肪酶處理前后的肉油及其在傳統浸制條件下浸泡60 d后的揮發性物質組成，結果見表2。

由表2可知，肉油中共檢測出43種揮發性化合物，包括5種醇類，4種醛類，11種酯類，16種碳氫化合物，1種呋喃，1種醚類和5種含氮化合物。

表2 肉油在傳統條件下浸泡0 d和60 d的揮發性化合物組成Table 2 Composition of volatile compounds in pork fat pulp soaked for 0 d and 60 d under traditional conditions mg/kg

續表

浸泡0 d時，普通肉油（對照組）和高酸價肉油的揮發性化合物組成相似。其中，2,4-二甲基己烷未在高酸價肉油中檢出，甲氧基苯肟未在普通肉油（對照組）中檢出。與普通肉油（對照組）相比，高酸價肉油中正己醛的含量顯著提高了229%（P＜0.05）。正己醛具有青草氣味，被認為是ω-6不飽和脂肪酸的氧化產物[23]，推測是脂肪酶的作用促進脂質降解和氧化。

浸泡60 d時，高酸價肉油的揮發性化合物種類共有38種，含量為（46.99±0.50）mg/kg，其種類和含量分別比普通肉油（對照組）提高40.74%和25.74%。其中，酯類和醛類物質的含量增加最明顯，高酸價肉油的酯類和醛類含量分別是普通肉油（對照組）的5.99倍和4.29倍，醛類物質含量的增加可能是高酸價肉油脂質氧化程度較高產生大量次級氧化產物導致的[16]；酯類物質含量的增加可能是來源于齋酒本身的成分擴散[24]，也可能來源于高酸價肉油氧化產生的酸類物質與齋酒中的乙醇發生的酯化反應[25]。與浸泡60 d的普通肉油（對照組）相比，高酸價肉油中的正己醛和壬醛分別是對照組的5.36倍和3倍。順-2-壬烯-1-醇、庚醛、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、9-癸烯酸乙酯以及一些芳香烯類物質為高酸價肉油特有的成分，未在普通肉油（對照組）中檢出。順-2-壬烯-1-醇被描述為綠色的、脂肪的味道[26]，庚醛具有獨特的脂肪香味[27]，而乙酯類具有強烈的果味和低閾值[28]，一些芳香烯如D-檸檬烯可以提供花香[29]、柑橘香[30]，α-蒎烯則可以提供薄荷香[25]。

對照組中，浸泡60 d的肉油的揮發性化合物的種類是浸泡0 d的3.86倍，其含量比浸泡0 d的提高了22.65%；高酸價肉油中，浸泡60 d的肉油的揮發性化合物的種類是浸泡0 d的5.43倍，其含量比浸泡0 d的提高了52.17%。說明齋酒浸泡過程能促進肉油和高酸價肉油的揮發性化合物釋放，且高酸價肉油比未經脂肪酶處理的肉油具有更高豐度的揮發性化合物。

3 結論

固定化脂肪酶處理肉油16 h可獲得高酸價肉油，其酸價是普通肉油（對照組）的66倍，達到（26.32±2.01）mg/g；該高酸價肉油在傳統條件下泡酒60 d后，其酸價和茴香胺值分別是普通肉油（對照組）的58.11倍和5.65倍，其過氧化值比對照組提高了32%，說明脂肪酶促進了脂質的水解和氧化。傳統泡酒過程中，高酸價肉油的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和脂肪酸總量的變化趨勢均與對照組普通肉油的變化趨勢一致，其中C16：0、C18：1和C18：0含量最豐富，分別占總含量的38.07%、28.54%和17.45%。脂肪酶作用前后肉油的揮發性化合物種類相差不大，但經過齋酒浸泡60 d后，其揮發性化合物的種類和含量都顯著提高，且高酸價肉油更具有產生豐富風味的潛力，其揮發性化合物的種類和含量較對照組分別提高40.74%和25.74%，其中酯類和醛類物質的含量增加最明顯，分別是對照組的5.99倍和4.29倍。綜上，固定化脂肪酶可以促進泡酒肉油的脂質氧化和揮發性物質產生，為豉香白酒肥肉陳化工藝創新提供潛在途徑。