三相萃取法提取啤酒廢酵母β-葡聚糖及其抗氧化活性研究

張 軍，聶 卉，李寒露，金夢佳，魏雙羽，張 凱，張云數，李乾偉

（鄭州工程技術學院 化工食品學院，河南 鄭州 450044）

β-葡聚糖是具有重要生物活性的天然多糖，主要來源于酵母等[1]。據中國食品工業協會發布數據[2]，2020年我國啤酒廢酵母產量3.41～5.17萬t[3]，廢酵母主要作為飼料發展畜牧業[4]。近年來，隨著營養學的發展，人們對酵母β-葡聚糖的功能如抗腫瘤[5]、益生元效用[6]、抑制和預防糖尿病[7]等越來越重視，因而，被廣泛應用于食品、醫藥等行業。美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）推薦每日攝入量3 g以上[8]，我國批準酵母β-葡聚糖為新食品原料[9]。酵母β-葡聚糖水溶性較差，如何從酵母中高效提取成為制約β-葡聚糖進一步應用的關鍵步驟。

酵母β-葡聚糖提取的方法主要有酶堿法、超聲波輔助酸或堿法、酸堿法等[10]，這些提取方法的共同特點是酸堿用量大，工藝過程復雜、提取時間較長和污染環境等缺陷[11]。三相萃取法是近年來發展起來的一種新型萃取分離技術，它是基于3個共存液相物化性質和親疏水性的差別，不同目標物在三相體系中的分配不同，實現復雜溶液中多目標的同時萃取分離和純化[12]。文沛瑤等[13]研究了三相萃取法純化枸杞多糖關鍵參數，YAN J K等[14]使用三相萃取法研究分離提純河蜆多糖的影響因素等。至今為止，三相萃取法己在天然產物、工業廢水、醫藥生產等許多復雜溶液的處理上表現出良好的應用的前景[15-17]，但在啤酒廢酵母β-葡聚糖分離提純的研究鮮見報道。基于三相萃取法高效、環保的特點，研究分離提純酵母β-葡聚糖的關鍵因素，為開發啤酒廢酵母資源化、產業化應用具有重要意義。

本試驗以啤酒生產廢酵母為原料，采用獨創的二級提取純化法：超聲耦合蛋白酶處理啤酒廢酵母（酸酶法）→三相萃取法分離提純β-葡聚糖，探索酵母β-葡聚糖的分離提純規律，測定β-葡聚糖的抗氧化性，以期為降低酵母β-葡聚糖生產成本、拓展應用領域提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母泥：由化工食品學院精釀啤酒工廠提供；酒石酸、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、硫酸銨（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；木瓜蛋白酶（300 IU/g）、叔丁醇、1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（98%）、2,2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（diammonium 2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS）（≥98.0%）、過二硫酸鉀（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

A1124分析天平、723PC型可見光分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；80～100目分樣篩：上虞市五四儀器篩具廠；KQ5200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；IRTracer-100傅立葉變換紅外光譜儀、ZH-13型壓片機：島津（中國）公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母β-葡聚糖提取液制備

啤酒酵母泥預處理：參照衣海龍等[18]的方法稍作修改。取適量酵母泥，3倍體積蒸餾水進行清洗，攪拌均勻，用80目篩除去80%可見雜質，用100目篩除去全部可見雜質。過篩后的樣液2 000 r/min離心處理5 min。去沉淀加入5%的酒石酸溶液（酵母泥與酒石酸溶液體積比1∶5），靜置40～60 min。酒石酸處理后的樣液再次2 000 r/min離心5 min，將上清液倒出，得到預處理后的酵母懸液。

蛋白酶耦合超聲提取酵母β-葡聚糖：參照石豪磊等[19]方法稍作修改。首先將酵母泥加入2倍體積蒸餾水進行稀釋，木瓜蛋白酶添加量為0.3%，在搖床中40 ℃酶解15 h，溶液pH值為5；酶解進行到14.5 h時，將反應體系放入超聲處理儀中，設置超聲頻率為40 kHz，30 ℃超聲處理30 min。將超聲處理后的懸液于3 500 r/min離心10 min，收取上清液，即得酵母β-葡聚糖粗提液。

1.3.2 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優化單因素試驗

取10 mL酵母β-葡聚糖粗提液，加入（NH4）2SO4使其含量分別為10%、20%、30%、40%、50%，再分別加入5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL叔丁醇溶液，制配三相萃取體系。調節pH至5.5，磁力攪拌10 min使三相混合均勻后于5 000 r/min離心10 min加速三相的萃取劑分離。將離心后的三相體系分別放置于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃條件下靜置萃取60 min，使其完全分離后，棄去上、中層，保留下層溶液，并測定多糖含量及萃取率。

1.3.3 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選取叔丁醇添加量（A）、（NH4）2SO4含量（B）、萃取溫度（C）為3個自變量，以啤酒酵母β-葡聚糖萃取率（P）為響應值，運用3因素3水平的響應面設計，選擇Design Expert 8.0.6軟件對試驗結果所得數據進行回歸分析。單因素變量分別以-1、0、1進行編碼，響應面試驗因素及水平見表1。

表1 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction and purification of yeast β-glucan by three-phase extraction

1.3.4 酵母β-葡聚糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定樣品中的酵母β-葡聚糖含量[20]，得到標準曲線的回歸方程：Y=0.2966X-0.00187（R2=0.9992）。

酵母β-葡聚糖提取率按式計算：

式中：M1為粗多糖質量，g；M2為啤酒廢酵母質量，g。

1.3.5 酵母β-葡聚糖抗氧化活性測定

DPPH自由基清除能力：參照馬吉鋒等[4]的試驗方法，稍作修改。

ABTS自由基清除能力：參照魏晨業等[21]的試驗方法，稍作修改。

清除率計算公式為：

式中：A0為不加樣品時的吸光度值；A為加入樣品后的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優化單因素試驗分析

2.1.1 叔丁醇添加量對酵母β-葡聚糖萃取率的影響

由圖1可知，隨著叔丁醇添加量的增加，啤酒酵母β-葡聚糖萃取率呈先上升后下降的趨勢。當叔丁醇添加量為10 mL時，啤酒酵母β-葡聚糖萃取率達到最大值為85.3%。當叔丁醇添加量繼續增加，萃取率反而減小，導致這一現象的原因可能是由于叔丁醇的含量過高不利于三相體系的穩定或叔丁醇與（NH4）2SO4溶液發生作用[14]。因此，三相萃取液最適叔丁醇添加量為10 mL。

圖1 叔丁醇添加量對酵母β-葡聚糖萃取率的影響Fig.1 Effect of tert-butanol addition on extraction rate of β-glucan from yeast

2.1.2 （NH4）2SO4含量對酵母β-葡聚糖提取率的影響

由圖2可知，當（NH4）2SO4含量從10%增至20%時，啤酒β-葡聚糖提取率緩慢升高，當（NH4）2SO4含量為20%時提取率最高，為84.3%。β-葡聚糖萃取率隨著（NH4）2SO4含量的增加逐漸升高，可能是因為NH4+、SO42-可以穩定溶液體系中的大分子相互作用，從而使得溶液體系更加穩定。（NH4）2SO4含量超過20%以后，β-葡聚糖萃取率開始下降，可能是由于無機鹽濃度過高導致多糖與水分子之間的作用力減弱，萃取率隨之降低[22]。因此，根據β-葡聚糖萃取率變化，確定最適（NH4）2SO4含量為20%。

圖2 （NH4）2SO4含量對酵母β-葡聚糖萃取率的影響Fig.2 Effect on (NH4)2SO4 contents on extraction rate of β-glucan from yeast

2.1.3 萃取溫度對酵母β-葡聚糖提取率的影響

由圖3可知，萃取體系的溫度從20 ℃上升至40 ℃時，酵母β-葡聚糖萃取率從73.6%增大至85.1%。在萃取體系中，隨著溫度的升高，暴露出來的更多羥基的有利于氫鍵形成，使得三相體系更加穩定，含多羥基的多糖親水性增強[23]，更多的β-葡聚糖從粗提掖中進入到萃取溶液下層，進而萃取率增加。當萃取溫度高于40 ℃并持續升高時，萃取率開始下降。因此，根據β-葡聚糖萃取率變化，選擇萃取溫度40 ℃為最佳。

圖3 萃取溫度對酵母β-葡聚糖萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of β-glucan from yeast

2.2 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優化響應面試驗結果及其分析

三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優化響應面試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表2 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments for extraction and purification of yeast β-glucan by three-phase extraction

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2數據結果進行分析，獲得叔丁醇添加量（A）、（NH4）2SO4含量（B）和萃取溫度（C）的多元二次回歸方程，確定以酵母β-葡聚糖萃取率（P）為目標函數的二次多項回歸方程為：

由表3可知，二次多項式擬合模型極顯著（P＜0.000 1），表明此模型極為顯著，即各因素與響應值之間相關性顯著。模型失擬項P=0.307 9＞0.05，表明模型的失擬項不顯著。顯著性結果分析表明，一次項A對酵母β-葡聚糖萃取率的影響顯著（P＜0.05），一次項B、二次項A2、B2、C2及交互項AB、BC對酵母β-葡聚糖萃取率的影響極顯著（P＜0.01）。各個因素對酵母β-葡聚糖萃取率影響的大小順序依次為：（NH4）2SO4含量＞叔丁醇添加量＞萃取溫度。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface tests results

根據回歸方程作響應曲面圖，根據擬合的響應曲面形狀，探討叔丁醇添加量、（NH4）2SO4含量以及萃取溫度對酵母β-葡聚糖萃取率的影響。分別將叔丁醇添加量、（NH4）2SO4含量以及萃取溫度的其中一個因素固定在0水平，得到另2個因素交互的影響結果，二次回歸方程的響應面及等高線見圖4。

從圖4根據曲面彎曲的程度可知，影響酵母β-葡聚糖萃取率最顯著的因素為（NH4）2SO4含量，極值靠近等高線圓心處，表現為響應面變化幅度較大，叔丁醇添加量也較為顯著，萃取溫度響應面幅度變化平緩，說明其對結果影響較小。

圖4 叔丁醇添加量、（NH4）2SO4含量及萃取溫度交互作用對酵母β-葡聚糖萃取率影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on effect on extraction rate of β-glucan from yeast

利用Design Expert 8.0.6軟件分析，得到最佳提取條件為叔丁醇添加量為9.4 mL，（NH4）2SO4含量為27.4%，溫度為35.7 ℃，酵母β-葡聚糖萃取率理論值可達94.25%。

為了驗證響應面分析法的可靠性，選取條件叔丁醇添加量為9.4 mL，（NH4）2SO4含量為27.4%，溫度為35.7 ℃，實際測得酵母β-葡聚糖得率90.13%，比回歸模型預測理論值低4.12%。該試驗結果比張桂香等[24]研究得率高，主要原因是本試驗采用的是在超聲耦合蛋白酶提取基礎之上的再次提純，響應面法相當于純化成品。因此，采用響應面法優化得到提取酵母β-葡聚糖最佳條件的數據可靠，具有使用價值。

2.3 酵母β-葡聚糖抗氧化活性

由圖5可知，酵母β-葡聚糖對DPPH、ABTS自由基的清除能力隨質量濃度增加而逐漸升高，當酵母β-葡聚糖質量濃度為8mg/mL時，對DPPH、ABTS自由基的清除率為60.5%、50.5%。相同質量濃度條件下，酵母β-葡聚糖對DPPH、ABTS自由基的清除能力均低于維生素C。多糖的自由基清除能力與單糖結構、分子大小、類別和構象有關[25]。酵母β-葡聚糖中的葡萄糖是還原劑，可以提供H+，H+可以與DPPH自由基結合，形成穩定的DPPH-H終止自由基反應[26]。

圖5 酵母β-葡聚糖對DPPH和ABTS的清除率Fig.5 Scavenging rate of DPPH and ABTS by β-glucan from yeast

表明酵母β-葡聚糖對于DPPH、ABTS自由基具有一定的清除作用，可作為天然抗氧化劑進一步研究，在多糖提取分離純化優化的前提下，其抗氧化活性可能會有一定程度上的增強。

3 結論

本研究采用超聲波耦合木瓜蛋白酶提取廢酵母中粗多糖，再使用單因素試驗和響應面優化三相萃取法萃取酵母β-葡聚糖提純工藝，利用軟件建立回歸模型預測提純的最佳提取工藝條件，結果表明，最佳提取條件為叔丁醇添加量為9.4 mL，（NH4）2SO4含量為27.4%，萃取溫度為35.7 ℃，在此條件下，酵母β-葡聚糖萃取率為90.13%。通過體外抗氧化試驗表明，試驗所得酵母β-葡聚糖對DPPH、ABTS自由基均有一定清除作用，且清除能力的強弱與酵母β-葡聚糖樣品濃度存在量效關系，當酵母β-葡聚糖質量濃度為8 mg/mL，清除率分別為60.5%、50.5%，表現出較好體外抗氧化活性。

本研究的其創新之處在于使用超聲波耦合木瓜蛋白酶提取廢酵母中粗多糖，得到的粗多糖經過三相萃取一步完成純化。結合響應面優化三相萃取的最佳提取條件，完成酵母β-葡聚糖純化，提取效率高，不使用大量的酸、堿，對環境友好。