離子色譜-電導法檢測格瓦斯中痕量溴酸鹽

鄒沫君，吳 麗，王 正*

（樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

溴酸鹽曾一度被烘焙業視為物美價廉的面團氧化劑而廣泛應用于食品行業[1-2]，在面團的發酵、醒發及焙烤工藝過程中起到一種緩慢氧化的作用，使用后面粉更白，發酵速度更快，制作的面包更蓬松更漂亮，更具彈性與韌性，可達到優質小麥面粉的效果[3-4]。然而必須指出的是，1992年世界衛生組織確認溴酸鹽是一種氧化性致癌物，長期食用會大大增加患腎癌、甲狀腺和腹膜間皮瘤的發病率[5-6]，禁用為面粉處理劑，許多國家也停止使用[7]。我國衛生部于2009年發布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》中明確規定，溴酸鹽屬于違法添加物質，食品生產加工企業在生產過程中不得使用溴酸鹽生產食品[8]。

格瓦斯是一種盛行于俄羅斯、烏克蘭及其他東歐國家的[9]，含低度酒精的飲料，采用俄羅斯大列巴面包干利用傳統發酵工藝釀造而成，顏色近似啤酒而略呈紅色，富含多種營養成分，如各種維生素、蛋白質、氨基酸、乳酸菌等[10-12]，不僅酸甜適度，清涼爽口，具有濃郁的面包味，口味極佳，而且能開胃、助消化、調節腸胃機能，具有增進機體新陳代謝，提高機體性能等保健功效[13-14]。隨著消費需求的不斷改變，格瓦斯作為一款營養健康的功能性飲品，受到我國許多消費者的喜愛，具有一定的市場潛力和發展空間[15]。

格瓦斯制作最主要的原料就是面包，可能會存在溴酸鹽的潛在風險。近年來開發了飲用水和面粉中溴酸鹽測定的多種儀器分析方法[16-18]，我國于2006年5月10日發布了GB/T20188—2006《小麥粉中溴酸鹽的測定離子色譜法》[19]。由此可見，溴酸鹽測定方法有多種，主要有氣相色譜法[20-21]、高效液相色譜-串聯質譜法[22-24]、離子色譜法（ion chromatography，IC）[25]、離子色譜-串聯質譜法[26-27]和離子色譜-電感耦合等離子體質譜法[28]等。前兩法均需對溴酸鹽進行衍生后檢測，較為繁瑣；而離子色譜與質譜已越來越多地聯用，其突出優點是檢出限低，分析速度快，但是由于設備昂貴、操作復雜，使其在常規分析中的應用受到了限制，不屬于常規設備，在基層單位很難推廣應用。離子色譜法分析食品中的溴酸鹽一直是研究的熱點，具有快速、方便、選擇性好、靈敏度高等特點，是近年來發展速度較快的分析方法之一[29]。目前，已廣泛應用于食品、藥物、環境、生物、農業、工業等各個方面[30]。

本研究探索建立了格瓦斯中溴酸鹽的離子色譜-電導檢測法，試樣經石油醚洗去油脂，用超純水振搖提取，依次過0.22 μm微孔濾膜、Dionex OnGuard II RP小柱及Dionex OnGuard II Ag/H小柱凈化后，用陰離子交換色譜柱IonPac AS 19（250 mm×4 mm）分離，電導檢測器檢測，測定格瓦斯中溴酸鹽的含量。旨在對格瓦斯中溴酸鹽快速靈敏的檢測提供參考，達到有效監控格瓦斯中溴酸鹽含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

格瓦斯：市售；溴酸根（BrO3-）標準品（100 μg/mL）（編號GNM-SBRO3-002-2013）：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；石油醚（沸程30～60 ℃）、氫氧化鉀（KOH）（均為分析純）、甲醇（色譜純）：天津市富宇精細化工有限公司；實驗室用水為超純水（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

Thermo ScientificTMICS-1100離子色譜系統、Dionex OnGuard II RP小柱（2.5 mL）、Dionex OnGuard II Ag/H小柱（2.5 mL）、IonPac AS 19分離柱（250 mm×4 mm）、IonPac AG 19保護柱（50 mm×4 mm）：美國Thermo SCIENTIFIC公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機：四川蜀科儀器有限公司；DT-110X30水浴恒溫振蕩器：上海篤特科學儀器有限公司；STAR星系列超純水機：上海礫鼎水處理設備有限公司；0.22 μm水系進口聚醚砜（polyethersulfone resin，PES）濾膜：美國頗爾公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

IonPac AS 19分離柱（250 mm×4 mm）、IonPac AG 19保護柱（50 mm×4 mm）；淋洗液源：帶有連續-再生陰離子捕獲柱（continuously regenerated anion trap column，CR-ATC）的洗脫液發生器（eluent generator cartridge，EGC）II KOH；梯度淋洗條件：0～12.0 min，8 mmol/L KOH；12.1～18.0 min，45 mmol/LKOH；18.1～23.0 min，8 mmol/LKOH；檢測器：電導檢測；抑制器：ASRS ULTRA II 4 mm，自循環電抑制，電流89 mA；流速：1.0 mL/mm；柱溫：30 ℃；定量環：500 μL。

1.3.2 標準溶液的配制

準確移取一定量的溴酸根（BrO3-）標準品，用水逐級稀釋成質量濃度分別為1.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、25.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L的標準工作溶液。在1.3.1色譜條件下進行測定，以溴酸根（BrO3-）質量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制溴酸根BrO3-峰面積-質量濃度標準曲線。

1.3.3 試樣制備

試樣提取：準確稱取2.5 g（精確至0.01g）試樣于100 mL具塞三角瓶中。加入20 mL石油醚洗去油脂，傾去石油醚，在50 ℃條件下干燥。加入50 mL超純水，迅速搖勻置振蕩器上振搖20 min，取下，靜置，轉入離心管中，10 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液備用。

試樣凈化：取上述備用上清液依次通過0.22 μm水系進口聚醚砜PES濾膜、Dionex OnGuard II RP小柱和Dionex OnGuard II Ag/H小柱，棄去前10 mL流出液，收集其后流出液直接進行色譜分析。Dionex OnGuard II RP小柱使用前用5 mL甲醇和10 mL純水活化，Dionex OnGuard II Ag/H小柱用20 mL純水活化，均放置20 min備用。

2 結果與分析

2.1 試樣前處理條件的選擇

格瓦斯是用面包干發酵釀造而成，但需要使用傳統的俄羅斯大列巴面包，在該面包的整個工藝配方中加鹽而不加糖，利用面包中的淀粉水解轉化成葡萄糖，類似于傳統的糯米酒釀，富含多種有機物質，其中不乏大分子物質。若試樣不經適當前處理程序，連續多次色譜分析后，此類大分子物質因與色譜柱基質間較強的親和作用，被吸附在柱內，不易洗脫，將導致柱效急劇下降。本試驗選用石油醚洗去油脂，水浴振搖提取法提高溴酸根（BrO3-）提取率，依次通過0.22 μm水系濾膜、Dionex OnGuard II RP小柱，利用共價吸附作用，捕獲殘余的大分子有機物，減少對色譜柱的污染。再經Dionex OnGuard II Ag/H小柱除去試樣提取液中Cl-，降低對溴酸根（BrO3-）測定的干擾，防止高濃度Cl-導致色譜柱過載。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

格瓦斯中常含有多種營養成分，因此在測定其中溴酸鹽時，需要選用柱容量較高的分析柱。IonPac AS 19離子色譜柱專為測定痕量溴酸鹽（一種臭氧消毒的毒副產物）設計，高柱容量和選擇性有助于測定μg/L質量濃度水平的溴酸鹽；該色譜柱是Dionex在聚合物鍵合技術方面的新進展，用高容量樹脂（60.240 ueq/column，4 mm）優化了柱子對溴酸鹽的選擇性，確保在使用抑制性電導檢測的情況下，即使存在超高濃度的氯化物、硫酸鹽和碳酸鹽，也能通過使用KOH梯度實現對低濃度溴酸鹽的定量測定。同時，這種聚合物親水性非常好，對KOH淋洗液選擇性很好，可以使用較低濃度的淋洗液。因此選用IonPac AS19作為分析住。

2.2.2 淋洗液系統選擇

CO32-型和OH-型是離子色譜分析陰離子常用的兩種淋洗液。其中，在色譜分析中應用范圍最廣的為CO32-型，但因其經抑制器轉化后為碳酸，碳酸部分電離出碳酸根離子與氫離子，導致背景電導較高，水負峰較大，靈敏度降低，需要對試樣進行濃縮等前處理，不適合大體積直接進樣與梯度淋洗。然而，OH-型淋洗液克服了上述不足，在線產生系統電解水生成高純KOH，經抑制器轉化為水，沒有碳酸鹽污染，具有較小的水負峰與較高的靈敏度，可以得到較好的保留時間重現性與較低檢出限。因此，選擇OH-型體系。

2.2.3 淋洗液濃度選擇

格瓦斯為面包汁發酵釀造，其制品中往往存在大量無機陰離子和有機酸。淋洗液濃度的選擇關系到待測組分BrO3-與試樣中無機陰離子及有機酸的分離效果評價與出峰時間的確定。由于BrO3-屬于親水性陰離子，在分析柱上保留相對較弱，因此一般情況下需要濃度較低的淋洗液進行梯度淋洗，從而得到良好分離效果。經過試驗摸索，綜合考慮試樣分離度和分析時間，本試驗最終選擇了8 mmol/L KOH作為初始濃度進行淋洗，待BrO3-出峰后，再使用高濃度45 mmol/L KOH淋洗液沖洗6 min分析柱，將吸附在柱上的強保留性物質（疏水性陰離子）洗脫下來，然后經平衡回到起始濃度。因此選用KOH梯度淋洗作為試驗條件，實現溴酸鹽的準確定量。

2.2.4 流速和柱溫耐受性考察

分別考察采用不同流速及柱溫進行測定時色譜行為的變化，見表1。以溴酸鹽質量濃度計，不同流速條件下相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值為0.51%，不同柱溫條件下RSD值為0.53%。由表1可知，在實際檢測過程中色譜條件（流速及柱溫）有微小變化時，溴酸鹽含量測定條件較寬，結果基本不受影響，系統具有較好的耐受性。因此，流速可選0.9～1.1 mL/min、柱溫可選29～31 ℃。

表1 系統耐受性試驗考察結果Table 1 Results of systematic tolerance test

2.3 色譜行為

經試驗探索，綜合考慮溴酸鹽保留時間及峰分離度等因素，最終選用1.3.1項色譜條件，實現了格瓦斯試樣中溴酸鹽的準確定量。溴酸鹽標準溶液、陰性試樣溶液以及陰性加標試樣溶液色譜圖見圖1。由圖1可知，該方法選擇性高，分離效果好，加標試樣出峰良好。

圖1 溴酸鹽標準溶液（A）、陰性試樣（B）及陰性加標試樣（C）離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of bromate standard solution (A),negative sample (B) and negative spiked sample (C)

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系、方法檢出限和定量限

取溴酸鹽系列標準工作溶液，按1.3.1中色譜條件進樣，以溴酸鹽峰面積對質量濃度計算線性回歸方程，確定相關系數。比較溴酸鹽色譜信號峰與基線信號，確定儀器最低檢出限（S/N=3），按試樣制備過程，得出方法檢出限與定量限，結果見表2。由表2 可知，溴酸鹽在1.0～100.0 μg/L范圍內線性關系良好（R2=0.9998），且該方法檢出限為0.048μg/g，定量限為0.16 μg/g，能完全滿足分析檢測要求。

表2 溴酸鹽的回歸方程、相關系數、檢出限及定量限Table 2 Regression equation,correlation coefficient,limit of detection and quantitation of bromate

2.4.2 精密度試驗

取50.0 μg/L溴酸鹽標準溶液，在上述條件下重復進樣6次，計算精密度試驗結果RSD，結果見表3。

表3 精密度試驗結果Table 3 Results of precision tests

由表3可知，溴酸鹽的保留時間和峰面積檢測結果的RSD分別為0.21%和0.44%。結果表明該檢測方法精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗

取制備好的格瓦斯供試品溶液，按“1.3.1”項色譜條件每間隔4 h進樣1次，測定溴酸鹽質量濃度，結果見表4。

表4 穩定性試驗結果Table 4 Results of stability tests

由表4可知，穩定性試驗結果RSD為0.49%，表明該檢測方法穩定性良好。

2.4.4 回收率試驗

分別精密稱取3份格瓦斯試樣，加入低（2.5 μg/L）、中（5.0 μg/L）、高（25.0 μg/L）3種質量濃度的溴酸鹽標準溶液。按上述方法提取、凈化后，進行色譜分析，對每個添加水平做3次平行試驗，計算各組分的平均回收率及其RSD，以考察方法的準確性，結果見表5。由表5可知，溴酸鹽的平均回收率在93.08%～98.05%范圍內，RSD為0.85%～1.16%。結果表明，該檢測方法準確度良好，符合分析檢測要求。

表5 加標回收率試驗結果Table 5 Results of standard recovery rate tests

2.5 實際試樣分析

利用本試驗所建立的方法，對市面上幾款格瓦斯飲品中痕量的溴酸鹽進行測定，結果見表6。由表6可知，該方法對這些試樣均具有良好的適用性，色譜無干擾，不同品牌格瓦斯中溴酸鹽本底含量存在一定的差異。

表6 格瓦斯試樣中溴酸鹽含量分析結果Table 6 Analysis results of bromate content in Kvass samples

3 結論

本實驗建立了離子色譜法測定格瓦斯中痕量溴酸鹽的方法：試樣經水浴振搖提取，采用固相萃取小柱凈化，以IonPac AS19陰離子交換色譜柱（250 mm×4 mm）分離，8～45 mmol/L KOH溶液梯度淋洗，抑制性電導檢測。該方法分離效果良好，操作簡便，靈敏度高，精密度、準確度及穩定性均能滿足實際檢測工作要求，值得推廣應用。