液體活檢在惡性腫瘤中的應(yīng)用

王紅兵

癌癥是一個全球性的主要公共衛(wèi)生問題[1]。2020年全球癌癥新報告和死亡病例一半來自中國[2]。我國社會人口老齡化的進程，成為近年來癌癥負擔(dān)增加的主要驅(qū)動因素[3]。液體活檢，以衍生于腫瘤部位的CTCs、循環(huán)游離DNA或RNA、外泌體等為標志物，從患者體液提取、分析的統(tǒng)稱，正在興起，并發(fā)揮作用于腫瘤診斷的早期應(yīng)用，確診后管理，風(fēng)險評估，轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)監(jiān)測[4～7]。CTCs和ctDNA在液體活檢領(lǐng)域應(yīng)用較早，已有商業(yè)化項目獲準應(yīng)用于臨床實踐。exosomes雖起步晚，但與CTCs和ctDNA相比，具有豐度高、來源廣、半衰期長的特點，成為液體活檢研究的新寵，近年來取得了不錯的進展。本文將以CTCs、ctDNA和exosomes為代表，對其分離、檢測方法以及在臨床上的應(yīng)用等進展進行綜述。

1 液體活檢生物標志物概述及檢測技術(shù)

1.1 循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)

1.1.1概述 1869年病理學(xué)家Ashworth在癌癥死亡患者血液中發(fā)現(xiàn)，有一類細胞，其形態(tài)與腫瘤形態(tài)相似，將其命名為CTCs。CTCs是一種從實體腫瘤病灶，包含原發(fā)和轉(zhuǎn)移病灶，自發(fā)脫落或受手術(shù)操作、活檢取材等外界刺激而被動脫落，以游離的單個細胞或多個細胞聚集的細胞團狀態(tài)，進入外周血液系統(tǒng)，并循環(huán)至全身的腫瘤細胞[4～6,8，9]。極少數(shù)CTCs在血液中存活，充當種子，傳播到遠處，完成轉(zhuǎn)移過程。已在許多不同的上皮細胞癌(肺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌)和不表達上皮來源標志物的癌癥(多形性膠質(zhì)母細胞瘤和黑細胞瘤)[4～6，8]被證實。CTCs攜帶了完整的來源于母體瘤的遺傳學(xué)信息，包含基因組、蛋白組等生物信息，可據(jù)此為信息源研究腫瘤組織，在癌癥的早診、療效觀察、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)監(jiān)測等方面發(fā)揮重要作用，為患者提供精準醫(yī)療依據(jù)，個體化治療指導(dǎo)[4～6]。CTCs還可作為細胞培養(yǎng)株，進行體外培養(yǎng)，作為藥敏試驗，早期預(yù)測不同類型癌癥的治療反應(yīng)[5]。

1.1.2檢測技術(shù) CTCs在進入外周血后，絕大多數(shù)會被免疫系統(tǒng)識別而清除，只有極少數(shù)能夠存活，血液中CTCs含量極低[8]。對CTCs進行檢測、分析的前提，是尋找效率高、特異性強、靈敏度好、細胞活性優(yōu)的捕獲、富集、分離技術(shù)。不同的血細胞，均有其獨特的物理、生物特性，目前常用的方法均是據(jù)此而設(shè)計開發(fā)[4～6,8～10]。物理法有基于細胞大小的微孔濾膜過濾法、基于細胞密度的密度梯度離心法、基于電荷的凝膠電泳法。生物法根據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)，依靠細胞表明不同的標志物和粘附分子，基于免疫磁珠、微流控芯片技術(shù)等進行針對性篩選，篩選出腫瘤細胞的為陽性富集，去除掉非腫瘤細胞的為陰性富集，有代表性的技術(shù)平臺為CellSearchTM、MagSweeperTM、CTC-Chip、nanotube-CTC-chip、CellCollectorTM等。CellSearch系統(tǒng)是一種體外富集系統(tǒng)，于2004年獲美國FDA授權(quán)，用于乳腺癌、前列腺癌和直腸癌的診療。CellCollector系統(tǒng)是一種新興技術(shù)，首創(chuàng)CTCs體內(nèi)捕獲方式，2012年獲得CE認證、2017年獲得CFDA三類認證，可用于肺癌、前列腺癌、乳腺癌等。富集完成后，可采用熒光標記技術(shù)結(jié)合免疫、核酸檢測技術(shù)，如免疫熒光、熒光原位雜交、流式細胞術(shù)、熒光定量PCR等，以及近年來興起的液滴數(shù)字PCR(Droplet Digital PCR，dd-PCR)和高通量測序技術(shù)(NGS)等對CTCs進行細胞形態(tài)、功能亞群、蛋白組學(xué)和基因組學(xué)分析和檢測[4～6,8～10]。近年來，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，通過整合單細胞RNA測序與CTCs分析，可識別癌基因的點突變和拷貝數(shù)變異等，能更好的證明CTCs的異質(zhì)性，并據(jù)此識別癌癥亞型，進一步揭示癌癥轉(zhuǎn)歸的分子機制，預(yù)測腫瘤表型轉(zhuǎn)化和耐藥，為患者提供真正個體化治療指導(dǎo)[5，9]。

1.2 循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)

1.2.1概述 在體液環(huán)境中，包括血液、腦脊液、尿液等，可檢測到一類游離的DNA片段，被稱為循環(huán)游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)。研究發(fā)現(xiàn)，cfDNA起源于腫瘤微環(huán)境的腫瘤和非腫瘤細胞，以及來自其他身體部位的細胞[10,11]。腫瘤細胞來源的cfDNA為ctDNA[11]。ctDNA攜帶的遺傳信息，與其母體細胞一致，可通過對ctDNA點突變、缺失/插入、甲基化修飾、拷貝數(shù)異常等的檢測，觀察其母體腫瘤基因缺陷和表觀遺傳學(xué)改變[4～6，11]，為腫瘤診斷、微小殘留病灶(Minimal Residnal Disease，MRD)、預(yù)后分析、轉(zhuǎn)移監(jiān)測等提供重要信息[4～6，11，12]。ctDNA中值半衰期為35分鐘，其豐度與腫瘤負荷呈正相關(guān)，可實時提示腫瘤進展[12]。

1.2.2檢測技術(shù) ctDNA在cfDNA含量很低，不到1%，從血液中提取足夠數(shù)量的ctDNA是保證檢測質(zhì)量的前提。目前主要使用商品化的試劑盒來提ctDNA，利用磁珠法和微柱離心法來吸附、洗脫、分離、純化ctDNA。ctDNA的檢測基于識別腫瘤特異性畸變或cfDNA 樣本中的表觀遺傳標記，有高靈敏度檢測預(yù)先指定的癌癥相關(guān)突變的超靈敏靶向方法，基于PCR技術(shù)的dd-PCR、磁珠乳液擴增技術(shù)、等位基因特異性PCR 、等位基因特異性不可延伸引物封閉 PCR、低溫共擴增 、肽核酸鎖定核酸PCR、甲基化特異性PCR和基于測序技術(shù)，如標記擴增深度測序技術(shù)、癌癥個體化深度測序分析(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)；有無偏倚地檢測基因組畸變的非靶向方法，全基因組測序(WGS)、全外顯子組測序(WES)、FastSeqS和NGS等[4～6,11]。dd-PCR因可實現(xiàn)核酸絕對定量，結(jié)果更加可靠，已成為近年來的研究熱點。

1.3 外泌體

1.3.1概述 外泌體是表面呈凹半球狀的類囊泡小體，具有立體膜結(jié)構(gòu)，直徑約40～100 nm[13]。外泌體來源廣泛，可由大多數(shù)細胞(免疫和非免疫)分泌，包括樹突狀細胞、淋巴細胞、肥大細胞和腫瘤細胞，廣泛存在于各種體液環(huán)境，具有脂質(zhì)雙膜，攜帶大量母體細胞信息，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸(DNA/RNA)等,參與許多生理、病理過程[14,15]。腫瘤微環(huán)境可提升外泌體的異質(zhì)性，改變外泌體大小及內(nèi)容物的功能，促進外泌體釋放，不同的癌癥衍生的外泌體差異很大。腫瘤來源外泌體攜帶腫瘤特征性信息，包括微RNA、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、信使RNA、環(huán)形RNA(circular RNA，circRNA)、DNA、蛋白質(zhì)等，介導(dǎo)腫瘤細胞間通訊、參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等，展示出了在腫瘤診斷、預(yù)后、監(jiān)測、轉(zhuǎn)移方面潛在的應(yīng)用前景[14,15]。

1.3.2檢測技術(shù) 外泌體的分離、提取是鑒定、研究、應(yīng)用最關(guān)鍵的步驟，目前的提取方法主要是基于密度、體積、分子表型等，有離心法(包括高速離心法、密度梯度離心法)、沉淀法、膜親和法、免疫磁珠法、超濾膜過濾法、尺寸排阻色譜法、適配體法、微流控芯片技術(shù)、商業(yè)試劑提取等[4，13～15]。提取后的檢測，則是根據(jù)所要檢測的靶目標，選擇有針對性的檢測方法。針對外泌體形狀和顆粒表征，電子顯微技術(shù)(掃描、投射電鏡和原子力顯微鏡)可展示表面形態(tài)信息，動態(tài)光散射可用于測量外泌體大小和 zeta 電位分布，納米顆粒跟蹤分析可用于確定顆粒濃度和尺寸分布；針對外泌體蛋白質(zhì)，選用酶聯(lián)免疫吸附試驗、蛋白印跡、流式細胞術(shù)、色譜分析、質(zhì)譜分析等；針對外泌體RNA和DNA，選用實時熒光定量PCR、數(shù)字PCR、NGS測序等方法；針對外泌體脂質(zhì)，常用質(zhì)譜分析技術(shù)[4，14，15]。新興跨學(xué)科技術(shù)的發(fā)展，為外泌體的分離和檢測提供了新的思路和手段。學(xué)者們開發(fā)出了基于脂質(zhì)分離、聲學(xué)隔離以及熱泳富集等新的分離方法，基于分子信標、DNA四面體探針、生物傳感器、熱泳傳感器、CRISPR/Cas系統(tǒng)輔助檢測和人工智能等新的檢測方法[7]。

2 液體活檢在臨床上的應(yīng)用進展

2.1 腫瘤預(yù)警及早期診斷液體活檢因技術(shù)靈敏度高，選用的生物標志物往往在腫瘤早期即可表現(xiàn)出異常，早于影像學(xué)改變及傳統(tǒng)的腫瘤標志物，可用于健康和高危人群腫瘤的預(yù)警及早期篩查。Cohen等[16]描述了一種通過血液檢測8種常見惡性腫瘤(肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌和食道癌)的方法，稱為CancerSEEK。該方法結(jié)合8種蛋白標志物與ctDNA分析16個基因中的相關(guān)突變，對1005例臨床診斷的前述8類非轉(zhuǎn)移性癌癥患者檢測，特異性≥99%，整體中位敏感性約70%，展示了ctDNA作為腫瘤早期診斷生物標志物的應(yīng)用前景。Chen等[17]選擇了10個外泌體circRNA，通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)篩選，分析比較肺腺癌(lung adenocarcinoma，LAUD)組和健康對照組血漿濃度，發(fā)現(xiàn)circ_0000690、circ_0001346、circ_0001439和circ_0001492在病例組的表達水平，在病程早期就已上調(diào)表達，circ_0001346和circ_0001492在對照組幾乎檢測不到，意味著circ_0001346和circ_0001492可作為LAUD早期診斷候選標志物。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，外泌體circ_002178在LAUD組表達顯著增加(AUC0.9956，P<0.001)；且在病例組中，來源于腫瘤細胞的外泌體circ_002178表達明顯高于正常人支氣管上皮細胞來源的外泌體；這些結(jié)果證實了血清circ_002178作為LAUD新的診斷標志物的可能性。Shi[19]等通過qRT-PCR技術(shù)，以分化拮抗非蛋白編碼RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR)為檢測目標，以乳腺癌、良性乳腺疾患和健康女性為目標人群，分析比較血清外泌體 lncRNA DANCR水平，發(fā)現(xiàn)血清外泌體 lncRNA DANCR 是一個乳腺癌獨立的風(fēng)險因素，與傳統(tǒng)標志物CA153、CEA聯(lián)合使用更是能大大提高診斷準確率。Li等[20]設(shè)計、實施了一項多中心前瞻性研究，以食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)患者和健康志愿者為隊列，包括試點隊列(ESCC 患者、對照各3例)和發(fā)現(xiàn)隊列(ESCC患者、對照各33例)，對唾液外泌體進行 RNA 測序來鑒定tRNA 衍生的小 RNA (tsRNAs)，發(fā)現(xiàn)，tRNA-GlyGCC-5和一種以前未鑒定的小RNA(因來源于ESCC 患者唾液的外泌體中，被命名為sRESE)組成的雙標記，能夠以高靈敏度 (90.50%) 和特異性 (94.20%) 區(qū)分ESCC患者與對照組，進一步展示了外泌體作為生物標志物，在腫瘤診斷方面的可行性和應(yīng)用前景。

2.2 腫瘤療效觀察及預(yù)后評估液體活檢技術(shù)因創(chuàng)傷小、取材方便、患者配合度和依從性較高，可以反復(fù)、規(guī)律性取材，有助于指導(dǎo)用藥、適時觀察療效和評估預(yù)后，實現(xiàn)腫瘤的精準化治療。 Heller等[21]對比轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌 (metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC)患者對比前列腺特異性抗原(PSA)和CTC0，對五項隨機三期臨床試驗進行了綜合分析，呈現(xiàn)的結(jié)果表明，使用 FDA 批準的 CellSearch 測定其定義的 CTC0 終點，CTCs 數(shù)量從可檢測(存在)到不可檢測(不存在)，是一種反應(yīng)指示生物標志物，與更長的生存期密切相關(guān)，與PSA相比，這是一個明確的讓患者受益的早期臨床指標。Lorente等[22]研究表明，對接受COU-AA-301(阿比特龍或安慰劑+強的松)和 IMMC-38(化療)的晚期前列腺癌患者，在治療前12周，CTCs數(shù)量的增加意味著更差的預(yù)后。 Goldberg等[23]通過對接受抑制劑治療的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的ctDNA研究，發(fā)現(xiàn) ctDNA 響應(yīng)，定義為ctDNA 水平下降低于基線值的一半，和射線照相響應(yīng)之間有很強的一致性，且 ctDNA反應(yīng)明顯早于射線照相反應(yīng)，達到 ctDNA 反應(yīng)的患者有更長的治療受益時間，以及優(yōu)越的無進展生存期和總生存期。Sandfeld-Paulsen等[24]通過細胞外囊泡陣列技術(shù)，以外泌體膜表面49 種蛋白質(zhì)為目標，用49種抗體對其進行可視化捕獲，對276 名 NSCLC 患者血漿外泌體分析表型，研究評估外泌體蛋白質(zhì)表型作為 NSCLC 的預(yù)后生物標志物，發(fā)現(xiàn) NY-ESO-1與預(yù)后顯示出了較強的關(guān)聯(lián)性，證明NY-ESO-1是一種強有力的NSCLC的預(yù)后生物標志物。Gauthier等[25]進行了一項前瞻性試點研究，以探索CTCs預(yù)測新輔助化療口咽癌患者預(yù)后，發(fā)現(xiàn)CTCs陽性變異的患者總生存期較低，表明可早期識別患者CTCs數(shù)量的變化，及早調(diào)整治療策略，提高生存率，同時限制不必要的治療副作用。

2.3 腫瘤MRD和復(fù)發(fā)監(jiān)測MRD是描述在治療期間或治療后留在體內(nèi)的極少數(shù)癌細胞的術(shù)語。這些殘留的癌細胞可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，卻無法通過影像學(xué)或臨床檢查檢測，只有采用靈敏度足夠高的實驗室方法，才能從海量正常細胞中檢測到這些癌細胞[6]。測序技術(shù)和生物傳感器的發(fā)展，顯示出了液體活檢在MRD 檢測方面可喜的成果，故可應(yīng)用液體活檢技術(shù)監(jiān)測MRD，用于療效觀察和復(fù)發(fā)監(jiān)測。Chaudhuri等[26]通過深度測序 (CAPP-seq) 進行個性化分析，以40例接受 I～III 期治療的局限性肺癌患者、54例對照的ctDNA為樣本(共計255份)，在可評估的復(fù)發(fā)患者中，多達94%的患者可在治療后的第一次檢測點檢測到ctDNA；在治療后可檢測到ctDNA 的患者均觀察到了不良結(jié)果，早于影像學(xué)進展。Hellmann等[27]對31例從PD-(L)1 阻斷劑治療中獲得長期益處(無進展生存期≥12個月)的晚期 NSCLC 患者，從治療期間/治療后的監(jiān)測時間點，通過CAPP-Seq分析 ctDNA，發(fā)現(xiàn)幾乎所有在監(jiān)測中檢測不到 ctDNA 的患者保持無進展，檢測到ctDNA 的患者最終均取得了進展。Garcia-Murillas等[28]進行了一項前瞻性研究，以55例接受新輔助化療的早期乳腺癌患者為隊列，在完成治愈性治療后，單次術(shù)后時間點或隨訪期連續(xù)檢測血漿ctDNA，以評估轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)風(fēng)險，證實ctDNA分析可以定義MRD，更準確地預(yù)測復(fù)發(fā)。Tie等[29]在一次前瞻性研究中，對230例手術(shù)切除的II期結(jié)腸癌患者，術(shù)后第一次隨訪時檢測ctDNA，ctDNA陰性組中90%達到了3年無復(fù)發(fā)生存，ctDNA陽性組則為0%。在上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma，UTUC)，Nakano等[30]2021年最新的研究也證實了ctDNA 可用于檢測 UTUC 患者根治性手術(shù)后的 MRD。

3 展望

目前腫瘤診斷的金標準仍是組織活檢。但傳統(tǒng)活檢需要從腫瘤部位提取組織標本，存在感染和內(nèi)出血的風(fēng)險，患者體驗性差。液體活檢，作為一種改進性診斷和監(jiān)測方案，從患者血液和其他體液提取生物標志物，無創(chuàng)或微創(chuàng)，可靈敏、方便地提供具體、準確的分子信息，逐漸受到越來越多的關(guān)注。液體活檢的生物標志物，可提供連續(xù)的基因突變信息，更好地反應(yīng)腫瘤時間和空間上的異質(zhì)性，包括侵襲性和整體分子景觀，用于腫瘤診斷、預(yù)后、MRD和轉(zhuǎn)移監(jiān)測等，并通過過早的介入和及時調(diào)整治療，提高癌癥患者的總體生存率。

盡管液體活檢在癌癥的早診、預(yù)后和監(jiān)測轉(zhuǎn)移方面，已證明了其無與倫比的優(yōu)越性，代表了一種前景良好的診斷和監(jiān)測方案，但大規(guī)模的臨床應(yīng)用仍面對不少挑戰(zhàn)。CTCs在外周血中豐度低、形態(tài)各異、異質(zhì)性強，目前單一的捕獲技術(shù)均存在一定的缺點，雙模態(tài)捕獲技術(shù)尚不成熟，還在研究之中。ctDNA在外周血中含量特別少，只能提示腫瘤負荷，無法確定腫瘤分期、定位。Exosomes的提取缺乏標準、快速、易行的方法，不同的方法有其獨到之處和各自的缺陷，尚缺乏能同時保證數(shù)量和質(zhì)量的方法。高靈敏的檢測方法，會產(chǎn)生一定的偏好性和假陽性。這些均限制了液體活檢在臨床上的應(yīng)用。不過，相信隨著技術(shù)的進一步發(fā)展，對癌癥病理機制的進一步認識，新的共識將不斷達成，液體活檢規(guī)范化、標準化的分離、提取和分析方法必將不斷建立；同時，隨著大量的多中心和前瞻性的臨床研究的開展，液體活檢的臨床有效性和實用性必將獲得進一步認可。