番石榴葉提取物對抵抗素誘導的人膝關節軟骨細胞炎癥的緩解作用及機制研究

王海斌，王 穎，田 昕，時 亮，姬 樂

(1.陜西省人民醫院骨科，陜西 西安 710068；2.陜西省中西醫結合醫院 西安市第五醫院中醫風濕科，陜西 西安 710082)

膝骨關節炎(Knee osteoarthritis，KOA)的發病率逐漸升高。研究[1]表明，軟骨細胞死亡與細胞外基質的丟失是關節軟骨退變和KOA病情發展的關鍵。其特征包括關節軟骨進行性退變和關節炎癥[2]。治療KOA的方法有限，只能緩解疼痛或進行關節置換[3]。減輕軟骨細胞凋亡和炎性反應是有效的KOA治療手段[4]。微小RNA(microRNA，miR)-181a-5p對高糖誘導的腎小球系炎癥反應具有明顯的調控作用，提示其在細胞層面的炎癥調控中的具有一定的作用[5]。抵抗素被認為是一種與炎癥疾病相關的因子[6]，具有獨特的表達模式和生物學功能。 番石榴葉為番石榴屬植物，研究[7]表明番石榴葉提取物(Guava leaf extract，GLE)具有抗水腫、抗炎、鎮痛作用。本研究探討GLE對抵抗素誘導的人膝關節軟骨細胞炎癥的緩解作用，并分析其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人膝關節軟骨細胞，20%胎牛血清加入10% DMSO混合均勻，置于4 ℃冰箱保存于本實驗室。

1.2 主要試劑 胎牛血清(貨號：11091，美國Gibco公司)；0.25%胰酶(貨號：15050065，美國Gibco公司)；青鏈霉素(貨號：V900929-100ML，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司)；DEME培養基(貨號：L110KJ，美國Gibco公司)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：BMS2279，美國賽默飛公司)；CCK-8試劑盒(貨號：C0037，上海碧云天公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記IgG二抗(貨號：31460，美國賽默飛公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號：ab181602，英國Abcam公司)；實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(貨號：ZY90408，上海澤葉生物科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(貨號：P0011，上海碧云天公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養及實驗分組：將本實驗室保存的人膝關節軟骨細胞培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37 ℃、含5% CO2培養箱中培養[8]。當細胞長至80%左右時，用0.25%胰酶進行消化傳代。將軟骨細胞分為對照組、抵抗素組(使用500 ng/ml誘導分離的軟骨細胞)及不同濃度(30、60、120 μg/ml)GLE組。

1.3.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞miR-181a-5p表達[9]：使用RNA提取試劑盒提取RNA，反轉錄后用生物系統Quant Studio 6 RT-PCR進行qRT-PCR，使用TBGreen?預處理ExTaqTMⅡ。擴增條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，40個循環；60 ℃ 34 s。試驗重復3次。以2-ΔΔCt法測定靶基因mRNA相對表達水平。

1.3.3 CCK-8檢測細胞增殖[10]：將軟骨細胞接種于96孔板，貼壁后加入番石榴葉乙醇提取物進行處理。將細胞分為對照組、抵抗素組及30、60、120 μg/ml GLE組。培養24、48、72 h后在每孔中加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃恒溫培養箱中培養2 h后使用酶標儀檢測490 nm波長處光密度(OD)值。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡[11]：將軟骨細胞接種于96孔板，培養48 h后收集細胞，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.5 Western blot檢測各組細胞凋亡蛋白[12]：取對數生長期軟骨細胞，37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h。將細胞分為對照組、抵抗素組及GLE(30、60、120 μg/ml)組。培養48 h后RIPA裂解緩沖液分離總蛋白。通過SDS-PAGE將蛋白裂解液分離，轉移到PDVF膜上。室溫下用脫脂牛奶封閉1 h，之后加入抗白細胞介素(IL)-6(1∶2000)、抗腫瘤壞死因子(TNF)-α(1∶2000)及抗TNF-β1(1∶2000)一抗。4 ℃下孵育過夜，用1×TBST沖洗膜，然后與HRP標記的IgG(1∶3000)二抗室溫下孵育1 h。以GAPDH(1∶3000)作為內參。最后ECL曝光，掃膜儀成像。目的蛋白包括裂解形式的半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(Cl-caspase-3)以及B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2關聯X蛋白(Bax)蛋白。

1.3.6 ELISA檢測各組細胞炎癥因子表達[13]：各組細胞相應孔中加入50 μl樣本分析緩沖液，室溫下孵育2 h，洗滌板5次。加入100 μl抗體工作液，室溫下孵育1 h。加入100 μl酶結合物，避光孵育20 min。加入顯色劑，避光孵育20 min。加入50 μl終止液，混勻后使用分光光度計測量450 nm處OD值，設置5個空白孔進行平行對照，根據標準曲線得到各指標濃度。 炎癥因子包括白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和TNF-β1。

2 結 果

2.1 各組細胞miR-181a-5p表達水平比較 見圖1。與對照組比較，抵抗素組軟骨細胞miR-181a-5p表達水平升高(P<0.05)。與抵抗素組比較，60、120 μg/ml GLE組軟骨細胞miR-181a-5p表達水平降低(均P<0.05)。后續實驗研究GLE濃度選擇為120 μg/ml。

注：與對照組比較，*P<0.05；與抵抗素組比較，#P<0.05

2.2 各組細胞增殖能力比較 見表1。與對照組比較，抵抗素組細胞OD值降低(P<0.05)。與抵抗素組比較，GLE組細胞OD值升高(P<0.05)。

表1 各組細胞增殖能力比較

2.3 各組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達比較 表2。與對照組比較，抵抗素組細胞凋亡率、Cl-caspase-3及Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低(均P<0.05)。與抵抗素組比較，GLE組細胞凋亡率、Cl-caspase-3及Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高(均P<0.05)。

表2 各組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達比較

2.4 各組細胞炎癥因子水平比較 見表3。與對照組比較，抵抗素組IL-6、TNF-α及TNF-β1水平升高(均P<0.05)。與抵抗素組比較，GLE組IL-6、TNF-α及TNF-β1炎癥因子水平降低(均P<0.05)。

表3 各組細胞炎癥因子水平比較

3 討 論

KOA嚴重影響人們身體健康與生活質量，給人們甚至社會帶來負擔[14]。臨床上，多是緩解關節疼痛，維持或改善關節功能，保護關節結構，但效果不理想[15]。患者常出現關節疼痛、腫脹和其他癥狀[16]。

研究[17]發現，番石榴葉水提物能有效抑制急性炎癥。KOA也是炎癥相關疾病，因此本研究也嘗試使用番石榴葉乙醇提取物作用于人膝關節軟骨細胞，試圖發現一些KOA防治的新策略。研究表明，抵抗素水平與KOA嚴重程度、軟骨磨損程度及滑膜炎嚴重程度呈現正相關[18]。同時，通過抵抗素水平的高低也能判斷膝關節病變的嚴重程度，因此抵抗素在減緩膝關節炎癥狀方面具有一定作用。miRNA可以作為KOA有前景的生物標志物[19]。miR-181a-5p可以保護IL-β誘導的軟骨細胞損傷[20]。本研究中，與對照組比較，抵抗素組軟骨細胞miR-181a-5p表達水平升高；與抵抗素組比較，60、120 μg/ml GLE組軟骨細胞miR-181a-5p表達水平降低，表明抵抗素可使人膝關節軟骨細胞miR-181a-5p表達水平升高，而GLE可降低降低抵抗素的這一作用。

KOA多發生于中老年人群中，疼痛、腫脹、限制性活動等是其主要的臨床癥狀[21]，其中的炎癥因子可以通過多種方式刺激級聯反應，觸發KOA[22]。TNF-β1可以參與多種疾病的發生與發展[23]。宮鳳艷[24]研究發現，TNF-β1發揮其調節細胞外基質成分沉積的作用，其表達水平升高時可加重腎臟損害。IL-6和TNF-α也是促進炎癥發展的主要因子。本研究結果表明，抵抗素組IL-6、TNF-α及TNF-β1炎癥因子水平較對照組升高，GLE組IL-6、TNF-α及TNF-β1炎癥因子水平較抵抗素組降低，表明GLE與抵抗素可能通過調節炎癥因子水平調控人膝關節軟骨細胞免疫應答。

Caspase-3是細胞凋亡的執行因子[25]。Bc1-2是抗凋亡蛋白，細胞凋亡信號會引起Bc1-2表達量變化。Bc1-2可進一步調節激活Caspase-3，誘導細胞凋亡[26]。本研究證實，與對照組比較，抵抗素組細胞凋亡率、Cl-caspase-3及Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低；與抵抗素組比較，GLE組細胞凋亡率、Cl-caspase-3及Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高。這些結果提示GLE與抵抗素對細胞的調控是通過對應的關鍵蛋白來完成的。但是細胞凋亡與增殖相關的靶點與通路有許多，本研究只是著眼于幾個標志性蛋白，具有一定的局限性，因此后續會從高通量入手，更廣泛地篩選GLE的作用通路與對應靶點，以進行更深入的研究。

綜上所述，GLE可緩解抵抗素誘導的人膝關節軟骨細胞炎癥，其機制可能與降低miR-181a-5p表達有關。但本研究不足之處在于，對治療機制的驗證不夠充分，后續加強完善，做更深層次的研究。