熒光定量PCR 檢測法在陰道加德納菌檢測中的 應(yīng)用價值

林爽

細(xì)菌性陰道炎作為一種育齡女性常見疾病,與女性陰道內(nèi)的加德納菌群情況存在密切關(guān)系［1］。研究顯示,在細(xì)菌性陰道炎患者的陰道內(nèi)微生物菌群中加德納菌處于顯著優(yōu)勢地位,且高于其他正常菌群［2］,因此,陰道內(nèi)加德納菌群的科學(xué)檢測對于提高臨床治療效果具有重要現(xiàn)實意義。當(dāng)前,臨床對于陰道內(nèi)加德納菌的檢查主要通過涂片革蘭染色發(fā)現(xiàn)線索細(xì)胞、免疫熒光檢測、細(xì)菌分離培養(yǎng)以及PCR 檢測等［3］。基于此,本次研究分別對比細(xì)菌性陰道炎女性和健康女性行熒光定量PCR 檢測加德納菌的臨床效果,分析PCR 檢測陰道內(nèi)加德納菌的診斷價值,詳情如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2019 年1 月～2020 年12 月收治的30 例細(xì)菌性陰道炎患者作為實驗組,另選擇30 例同期健康體檢的健康女性作為對照組。實驗組年齡18～45 歲,平均年齡(33.84±5.49)歲。對照組年齡18～45 歲,平均年齡(33.92±5.45)歲。兩組年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 實驗組符合細(xì)菌性陰道炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；對照組不存在任何陰道炎病變；兩組患者均知曉本次實驗,且自愿參與,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 研究對象存在傳染病變；凝血功能障礙；哺乳或孕期。

1.3 方法 兩組研究對象均接受熒光定量PCR 檢測法檢測,采用無菌棉拭子在女性陰道壁下1/3 處部位采集分泌物,并將其放于無菌試管內(nèi)送檢。棉拭子需在PBS 緩沖液匯總進(jìn)行震蕩懸浮后對其進(jìn)行離心處理,隨后收集沉淀菌體。根據(jù)提及試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA,并放于-70℃環(huán)境中保存。加德納菌的引物合成參考文獻(xiàn)［3］。

定性PCR 反應(yīng)體系下,保證上下游引物分別各為0.5 μl,模板設(shè)置為3 μl,使用雙蒸水補足25 μl。PCR 循環(huán)參數(shù)需設(shè)置為94℃環(huán)境下預(yù)變形5 min,94℃下進(jìn)行45 s,55℃下進(jìn)行45 s。將加德納菌標(biāo)準(zhǔn)菌株放置于LB培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),并選擇單個培養(yǎng)菌落,提取細(xì)菌基因組的DNA 對其進(jìn)行常規(guī)的PCR 擴(kuò)增處理,并使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。陽性產(chǎn)物切膠純化之后回收,并對其進(jìn)行連接反應(yīng),實際操作步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行詳細(xì)操作。調(diào)節(jié)基線至合適的位置,保證各個熒光曲線與基線的交叉點作為主要的數(shù)值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度以及數(shù)值對應(yīng)關(guān)系獲取各個待檢測標(biāo)本的初始濃度。針對不同濃度的DNA 模板進(jìn)行連續(xù)熒光定量PCR 反應(yīng),根據(jù)濃度做平行管,合理計算變異系數(shù)。

1.4 觀察指標(biāo) 對比兩組定性PCR 檢測結(jié)果以及陽性率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定性PCR 檢測結(jié)果 實驗組標(biāo)本進(jìn)行實時定性PCR 檢測后PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測后可以發(fā)現(xiàn)111 bp 特異性條帶。對其進(jìn)行序列分析,實驗結(jié)果與同源性對比發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增DNA 片段與序列符合率100%。

2.2 陽性率 依據(jù)Amsel 診斷標(biāo)準(zhǔn),實驗組30 份樣本中加德納菌陽性標(biāo)本數(shù)為28 份,陽性率為93.33%；對照組30 份樣本中加德納菌陽性標(biāo)本數(shù)為12 份,陽性率為40.00%。實驗組加德納菌陽性率高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.2000,P=0.000＜0.05)。

3 討論

陰道炎中不同的病原菌可導(dǎo)致不同類型的陰道炎,如滴蟲性陰道炎、細(xì)菌性陰道炎和霉菌性陰道炎［4］。滴蟲性陰道炎患者會出現(xiàn)陰道不適、疼痛瘙癢的癥狀,呈黃綠色稀薄的泡沫樣白帶。細(xì)菌性陰道炎是由陰道內(nèi)加德納菌導(dǎo)致的一種陰道炎癥。細(xì)菌性陰道炎作為婦科常見的疾病,其主要以女性陰道內(nèi)菌群比例失衡作為主要病變的傳染性病變［5］。細(xì)菌性陰道炎病因尚不明確,但部分學(xué)者認(rèn)為是由于加德納菌與厭氧菌混合感染所致,其是該病的主要發(fā)生因素［6］。現(xiàn)階段,臨床微生物檢查中常規(guī)的分離檢查方法是基礎(chǔ)診斷措施,應(yīng)用范圍比較廣泛。傳統(tǒng)的細(xì)菌實驗室檢查以及鑒別,主要是根據(jù)細(xì)胞的組織形態(tài)性特征以及生理性狀,對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)以及生化反應(yīng)、免疫學(xué)檢測等［7］,檢測環(huán)節(jié)十分復(fù)雜,且無法給出理想的鑒定結(jié)果。隨著我國分子生物學(xué)的發(fā)展,PCR 技術(shù)以快速、敏感以及特異的優(yōu)勢,靈活用于微生物檢測中。

細(xì)菌性陰道炎、其他類型陰道炎以及健康女性陰道分泌物都能檢出加德納菌。研究顯示,細(xì)菌性陰道炎患者和健康女性檢查中的加德納菌檢出率存在顯著差異［8］。因此,不能單純對細(xì)菌性陰道炎女性進(jìn)行PCR 檢測,還需對其進(jìn)行定量研究,以此明確檢測結(jié)果,為臨床醫(yī)生提供更多的診斷數(shù)據(jù)。熒光定量PCR檢測法是一種可以進(jìn)行定量檢測的基因擴(kuò)增的PCR 技術(shù),此種檢測技術(shù)的住院原理是在PCR 系統(tǒng)中添加一些熒光染料或者熒光分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈,通過物質(zhì)和PCR 相結(jié)合產(chǎn)生特定的物質(zhì),且此種物質(zhì)在紫外線的刺激之下,可以發(fā)生特定的熒光。檢測人員通過觀察實驗檢測的熒光信號可以將檢測體系中相關(guān)數(shù)值顯示出來,促使檢測人員可以將檢測的基因數(shù)量拷貝出來,并根據(jù)其推理最初的基因數(shù)量。熒光標(biāo)記的探針匯總主要包括水解探針和雜交探針［9］。而熒光定量PCR 檢測法中主要包括［10-12］：①絕對的定量措施,通過構(gòu)建合理的基因序列標(biāo)準(zhǔn),并對其進(jìn)行一系列的定量檢測工作,將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行合理的稀釋工作之后可以獲得多個不同稀釋之后的循環(huán)閾值(Ct 值)數(shù)值。而Ct 數(shù)值也是被檢測標(biāo)本熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)量,其主要是將核算數(shù)量作為根本的橫坐標(biāo),將log(Ct)作為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其通過檢測標(biāo)本的Ct 值在坐標(biāo)上的位置可以基本判定檢測標(biāo)本的核算數(shù)量；②相對定量：其主要是檢測人員根據(jù)公式進(jìn)行推到獲得的基因,可以直接對目的基因相對管家基因的量,檢測人員不需要做一些額外的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其具有簡便、省時等優(yōu)勢。

熒光定量PCR 檢測法還具有以下幾種檢測優(yōu)勢：檢測人員可以實時檢測檢測標(biāo)本的基因擴(kuò)增數(shù)量,并定量估算樣本中存在的基因初始數(shù)量,并經(jīng)過檢測中的熒光信號清晰獲取PCR 的全過程［13］。檢測人員進(jìn)行的操作比較簡單,且需要消耗的檢測時間比較短,其具有較高的特異性以及靈敏度,可以顯著提升檢測的準(zhǔn)確性［14］。檢測人員在封閉的環(huán)境中進(jìn)行熒光定量PCR 實時檢測工作,可以顯著降低標(biāo)本發(fā)生污染的幾率［15］。現(xiàn)如今,熒光定量PCR 已經(jīng)獲得積極普及使用,而對于mRNA 基因的表達(dá)研究、多個不同基因的定量分析、點突變的分析以及等位基因分析、單核苷酸多態(tài)性分析以及多個微生物,都可以進(jìn)行定量、定性的檢測分析工作［16］。

本次研究顯示,實驗組標(biāo)本進(jìn)行實時定性PCR 檢測,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測后可以發(fā)現(xiàn)111 bp 特異性條帶。對其進(jìn)行序列分析,實驗結(jié)果與同源性對比發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增DNA 片段與序列符合率100%。實驗組加德納菌陽性率高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。由此可見,對細(xì)菌性陰道炎患者進(jìn)行實時熒光定量PCR 檢測法檢測,可以靈活檢測出陰道內(nèi)的加德納菌含量,進(jìn)而為醫(yī)生的診斷提供依據(jù)。本次實驗通過建立實時熒光定量PCR 檢測細(xì)菌性陰道炎女性體內(nèi)的加德納菌含量,其具有靈敏度、可重復(fù)操作的優(yōu)勢,可以準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的加德納菌DNA 含量,幫助醫(yī)生對患者進(jìn)行更好的診斷。

綜上所述,對細(xì)菌性陰道炎患者進(jìn)行實施熒光定量PCR 法檢測檢測加德納菌,可以幫助醫(yī)生剛好診斷病情,提高診治效果。