廣西德保矮馬冷凍精液制作與保存

文│鄧祝新 王國利 魏莎 李敏玲 許春榮 王英群 韋慧華 李牮伸 鄒樂勤 洪紹鋒（廣西壯族自治區(qū)畜禽品種改良站）

當前，世界上的大多數(shù)國家都在建立畜禽基因庫，畜禽基因庫中有精液、胚胎、體細胞等遺傳材料。家畜精液保存目的是將優(yōu)良品種（包括地方優(yōu)良品種）的精液進行冷凍，長期保存，這對保種和未來育種十分重要。家畜精液保存技術(shù)是隨著人工授精技術(shù)的推廣使用而產(chǎn)生的，原理是通過降低或抑制精子新陳代謝達到延長精子壽命的目的。家畜冷凍精液發(fā)展迅速，特別在牛方面成效顯著。廣西壯族自治區(qū)2022年開始進行馬冷凍精液保存研究，目前還處在試驗改進階段。本研究旨在尋求能確保獲得較好凍后存活率的有關(guān)稀釋液配比和降溫速度等一些因素的“最優(yōu)”組合。

廣西德保矮馬研究所位于廣西百色市德保縣境內(nèi)，是現(xiàn)存、惟一的德保矮馬保種場。德保矮馬是我國最矮的地方馬種之一，也是世界稀有珍貴馬種，據(jù)文獻記載，德保矮馬是“吉祥馬”的象征。德保矮馬身高76～104厘米，具有性情溫順、體型矮小、體質(zhì)結(jié)實、體小力大、適應性強、耐粗飼、抗病力強等優(yōu)良特性，德保矮馬用途廣泛，可用于使役、騎乘、觀賞和科研等。目前，純種德保矮馬數(shù)量較少，必須立即開展保種工作，采集德保矮馬的遺傳材料，包括精液、胚胎、體細胞等。一直使用熏蒸冷凍法制作德保矮馬冷凍精液，導致德保矮馬凍精質(zhì)量一直不夠理想。現(xiàn)在筆者針對如何提升德保矮馬冷凍精液質(zhì)量做了更深一步研究。采用法國卡蘇IMV公司提供的冷凍精液制作方案進行德保矮馬冷凍精液生產(chǎn)。

一、采精種公馬的選擇

按照《NY/T 1900-2010畜禽細胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范》，從保種場中不少于6個家系中挑選10匹公馬。公馬要求符合品種特征、特性，系譜清楚，三代以內(nèi)無親緣關(guān)系，體況健康，無傳染性疾病和遺傳疾病。

二、采精前的準備

假陰道的準備：使用法國卡蘇公司生產(chǎn)的整套采精設(shè)備，包括采精筒、內(nèi)膽、皮外套、集精杯、專用塑料內(nèi)胎、漏斗。采精前向假陰道內(nèi)胎夾層灌入3500～4000毫升（45±2）℃熱水，而后在假陰道入口前l(fā)／2段用玻璃棒均勻涂抹潤滑劑（液體石蠟油），無需打氣。灌水量視公馬陰莖的粗細、長短而調(diào)整。采精過程中內(nèi)胎溫度為（45±2）℃。

臺馬的準備：選擇與種公馬相匹配、健康溫順的母馬，將發(fā)情母馬牽引到采精棚內(nèi)保定好，依次用2%來蘇爾液和清水清洗后軀和外陰部，用干凈毛巾擦干，隨后將公馬牽引到母馬背后準備采精。

三、采精方法

將種公馬牽至采精場，以臺馬刺激其性欲。采精時，采精員右手持假陰道把柄并靠在右臂肘處，公馬爬跨時立即站于臺馬右側(cè)，左手輔助將陰莖導入假陰道內(nèi)；公馬射精后將假陰道的集精杯端放低并打開活塞放氣，充分排精后，緩慢將假陰道豎起并移開，迅速送檢。

四、采精頻率

成年公馬每周采精1次（每次采精需要爬跨3次）；青年公馬每周l～2次（訓練青年公馬形成采精條件反射）。

五、精液品質(zhì)檢查

取下集精杯，用馬精液專用過濾紙做成漏斗狀，將新鮮矮馬精液注入漏斗中，過濾出干凈的原精，收集到一個100毫升的三角燒杯內(nèi)，在室溫環(huán)境下進行檢查。

1.外觀檢查。射精量：用量筒測量精液量。色澤：正常情況下為淡乳白色或灰白色，帶有淡綠色、淡紅色、黃色、紅褐色等異常顏色的精液應廢棄。氣味：新鮮精液略有腥味，氣味異常的應廢棄。

2.顯微鏡檢查。精子活率評定：檢查時用移液槍取10微升，滴在載玻片上加蓋玻片，在400～600倍顯微鏡下觀察，每個滴片不得少于3個視野，求其活力的平均值。顯微鏡載物臺溫度應保持37～38℃。精子活率＜ 0.7的精液應廢棄。

精子密度檢查：種公馬每次采精應測定1次精子密度。血細胞計數(shù)器測定法：用白細胞細管吸取一定的原精，再吸取3%氯化鈉溶液將原精稀釋10倍，混合均勻后，用細胞計數(shù)器在顯微鏡下放大400倍計數(shù)，計算每毫升精液中的精子數(shù)。

3.精液品質(zhì)檢查記錄。精液品質(zhì)檢查記錄表包括種公馬馬場名稱、種公馬號、年齡、品種、毛色特征、采精日期、采精量（毫升）、顏色、氣味、pH、密度（億個/毫升）、活率、稀釋液種類、稀釋后活力、采精員、檢測員及備注。

六、鮮精的稀釋與平衡

1.鮮精的第一次稀釋與平衡。鮮精密度測量：使用卡蘇公司生產(chǎn)的家畜精子專用密度儀（ACCUREAD），取40微升原精，注入2.4毫升生理鹽水中，混合搖勻，進行密度測定，并做好數(shù)據(jù)記錄。

鮮精第一次稀釋方法：使用卡蘇公司生產(chǎn)的馬專用稀釋液（離心稀釋液INRA 96），等溫加注，與原精按1∶1的比例混合均勻，然后在37℃的溫水中水浴，等待進行離心之前的配平。

2.鮮精的離心。將第一次稀釋后的原精液用50毫升的離心管分裝，配平至2～4管，每管加入1～2毫升的離心緩沖劑。注入離心緩沖劑的方法：首先取出一管精液，將一根吸管直插到精液底部，然后用注射器抽取1～2毫升的離心緩沖劑（MAXI FREEZE ），從吸管頂部注入，直達精液底部，不能晃動吸管，讓緩沖劑停留在底部，然后抽出吸管即可完成一份。以此類推，逐一加完其他管子。之后進行離心，2500轉(zhuǎn)20分鐘即可。取出離心管，去掉上清液部分，直至保留精液層為止，再用無菌一次性注射器，垂直插到精液底部，把離心緩沖劑抽取干凈，最后只剩下離心后的精子層。

3.鮮精的第二次稀釋。具體計算方法如下：

鮮精密度×精液體積＝精子總數(shù)

精子總數(shù)/每管精子總數(shù)＝分裝管數(shù)

分裝管數(shù)×每管體積＝加入冷凍液與抗凍劑的體積

根據(jù)計算結(jié)果，分別加入冷凍稀釋液（INRA Freeze）與抗凍劑。一邊稀釋，一邊鏡檢觀察鮮精的密度，采取理論與經(jīng)驗相結(jié)合的方法進行稀釋。一般情況下，實際量要少于理論值。

稀釋要求：

（1）灌裝使用0.5毫升的細管;

（2）5000萬有效精子數(shù)/支（0.5毫升）;

（3）1.5億總精子數(shù)/支（0.5毫升）;

（4）鮮精的活力達0.7以上為符合冷凍制作要求。

4.鮮精的平衡與分裝。在常溫環(huán)境下，把德保矮馬鮮精液稀釋后水浴，然后靜置于4℃的恒溫冰箱內(nèi)。等待90分鐘后，在4℃的平衡柜里進行分裝。分裝要求：使用0.5毫升的細管進行精液分裝、封口。并且在細管上打印產(chǎn)地、品種標識和日期。最后在細管凍精包裝的時候要注明標簽、專人保管、存放管理。

七、冷凍精液的制作

冷凍制作使用了法國卡蘇公司的精子冷凍儀設(shè)備。將分裝好的細管精液排在冷凍專用架子上，迅速放置于冷凍柜內(nèi)進行冷凍制作。在電腦軟件中選擇馬凍精制作專用程序，打開程序進行冷凍過程。整個冷凍時間為5分鐘左右，以60℃/分鐘的速度降溫，把細管精液從4℃快速冷凍到-140℃。產(chǎn)品即可成型，然后打開冷凍儀，把細管精液從里面快速取出，瞬間完全浸泡到液氮里，直至液氮沸騰消失。此時，完成冷凍制作過程。

八、解凍與鏡檢

首先，用鑷子從液氮中取出凍精，空氣浴2～3秒。然后迅速完全浸泡到38.5℃的恒溫水浴鍋中，搖晃解凍1分鐘，取出、剪管，將全部精液擠入到指型管中，水浴。在電子顯微鏡下鏡檢：用移液槍吸取10微升滴在載玻片上，置于恒溫板上進行鏡檢。活力等于或大于0.3的為合格凍精。

九、精液冷凍保存

按照《NY/T 1900-2010畜禽細胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范》，對選定德保矮馬精液進行保存。每匹公馬保存凍精不少于300支，冷凍精液質(zhì)量要求：劑量≥0.4毫升，精子活力≥0.3，直線前進運動精子數(shù)≥5.0×107，精子畸形率≤25%，細菌數(shù)≤800個。細管標記：以漢語拼音縮寫標明公馬品種、公馬號、生產(chǎn)日期（如德保矮馬5號2021年12月31日生產(chǎn)，印字為：DBAM 5 2021 12 31）。標簽要求標記如下內(nèi)容：品種、個體號、生產(chǎn)日期、數(shù)量、解凍后精子的活力、袋號。