睪丸間質細胞傳代、凍存、復蘇初步研究

文│呂雙陽（山東省海陽市二十里店鎮畜牧獸醫站）

隨著對細胞的不斷傳代，優勢細胞逐漸生長，傳代培養的細胞梭形占比逐漸加大，而生長速度慢或是生長活力低的細胞會被逐漸淘汰。細胞凍存復蘇后的狀態與凍存保護劑種類、凍存時間、凍存方式、細胞復蘇方法等有關，也與各種生物學試驗結果有關。為了更好地建立細胞庫，實現其相應價值，筆者對此進行了試驗探索，下面則是具體的試驗過程和相關結論。

一、材料與方法

1.主要試劑。RPMI-1640培養基（GIBCO）、胎牛血清（HyClone）、Ⅱ型膠原酶（Sigma）、胰酶、臺盼藍、二甲苯。

2.試驗動物。健康3周齡的榮昌公豬。為了增強試驗效果的普遍適用性，本次選擇過程采取隨機選擇的方式，盡量降低人為干擾。

3.試驗方法與檢測方法。試驗方法及檢測方法都會對最終的結果產生一定的影響，因而為了選擇更佳的榮昌仔豬睪丸間質細胞傳代及凍存復蘇培養方法，筆者嘗試進行如下方法。

（1）仔豬睪丸間質細胞的傳代及凍存與復蘇。睪丸間質細胞的傳代培養：為了試驗的精準性，在睪丸間質細胞傳代培養過程中有很多注意事項，下面對此進行具體剖析。進入試驗階段的原代細胞需要經過一定的篩選和過濾，這不僅是為了試驗的精準性，同時也是為了更好地普及和推廣相應方法。基本原則為：細胞單層大概要長到95%左右最好，然后舍棄其中的營養液。先用新鮮培養液清洗、棄去，然后加入1～2毫升的0.25%胰酶，靜置5～10分鐘，棄去胰酶后加入培養液，用吸管吸取培養液，并反復吹打培養瓶瓶壁細胞，形成細胞懸液。將細胞懸液吸入10毫升離心管中，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養液，移入新的培養瓶中，37℃，5% CO2，飽和濕度下培養。24小時后換液，以后每天換液一次。

睪丸間質細胞的凍存與復蘇。細胞凍存：選用傳代第一次的細胞，細胞消化同傳代培養的方法，將細胞懸液收集至離心管中，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，細胞沉淀中加入凍存培養液（含10%的DMSO），移入凍存管中，計數，細胞濃度為5×106/毫升左右。

采用兩種方法對細胞進行凍存。

慢凍方法：將培養的細胞分為4組，然后分批次、分溫度、分時間進行冷凍，具體溫度和時間如下：首先將凍存管放到4℃的冰箱中，靜置40分鐘，然后放到-20℃的冰箱中0.5～1小時，之后將其放到-80℃的冰箱中，這種冰箱屬于超低溫冰箱，此時需要將凍存管進行過夜放置，最后將其放到液氮罐中保留。這種方法環節較多且操作嚴格，需要格外細致。

快凍方法：第一步與慢凍方法一致，也是劃為4組，將凍存管（管口要朝上）放到紗布袋內，放入-80℃超低溫冰箱中過夜，第二天就可以觀察其變化，然后直接放入液氮罐中保存。雖然快凍方法中突出的是速度、時間問題，但其中所要注意的事項也不容忽視，尤其是紗布清潔度、溫度控制及第二天的觀察精細度等也都要格外注意。

細胞復蘇：既然是復蘇就需要有一個解凍過程，具體操作步驟如下：首先從液氮罐中提取細胞，整個過程中也應注意清潔度、緩慢度，確保提取出來的細胞生命體征及特點不受外界因素干擾。然后放到適宜的溫度中進行融化，溫度約為38℃，融化時間控制在1分鐘左右即可，然后用培養液稀釋，低速離心10分鐘，棄去上清，加新鮮培養液培養剛復蘇的細胞。將細胞懸液與0.4%臺盼藍染液以9∶1比例混勻，并取少量混合液滲入計數板和蓋玻片的間隙中，血球計數板計數，細胞復蘇率的計算公式如下：

復蘇率/%＝（活細胞數/細胞總數）×100

總之，復蘇過程相對復雜，涉及的環節比較多，在試驗過程中要格外注意。

（2）仔豬睪丸間質細胞的鑒定。臺盼藍染色的活力測定：臺盼藍染色的活力測定需要一定的配比控制，具體將細胞懸液與0.4%臺盼藍染液按9∶1的比例混勻。取少量混合液滲入到計數板和蓋玻片的間隙中，在顯微鏡下計數，主要觀察藍色的死細胞數量變化以及無色透明的活細胞數量變化，活細胞就代表細胞的活力，活細胞越多會導致活細胞率逐漸提升，具體計算公式如下：

活細胞率/%＝[活細胞總數/（活細胞總數＋死細胞總數）]×100

3β-HSD細胞純度鑒定：在倒置顯微鏡下觀察經3β-HSD染色的細胞懸液，細胞質中會出現一些藍色顆粒狀細胞，這就是常說的睪丸間質細胞。此時用陽性來代表純度，純度鑒定由此展開，具體計算公式如下。

陽性細胞率/%＝（3β-HSD陽性細胞數÷總細胞數）×100

二、試驗結果

1.仔豬睪丸間質細胞傳代及凍存與復蘇。

（1）睪丸間質細胞傳代生長狀況。傳代細胞經過1天左右的變化就可以觀測到睪丸間質細胞貼壁的動態，基本是次日開始出現觸角，此時隨著代數的不斷增多，細胞梭形也會開始產生變化，如占比逐漸提升。如圖1、圖2。

（2）睪丸間質細胞凍存與復蘇結果。本試驗中應用的凍存劑是10%二甲亞砜，其具有分子量小、溶解能力強、滲透能力強等特點，也是應用最廣的凍存保護劑。試驗采用兩種不同的冷凍方法后發現，采用慢凍方法冷凍后細胞復蘇率較高。冷凍速度對細胞內部的影響十分明顯，尤其是生理變化值得探究。經過試驗可以得出如下結論，冷凍速度直接會影響細胞水分及體積，具體表現特征為如果冷凍速度偏慢，細胞脫水問題比較明顯，導致細胞體積縮小，一旦達到一定程度，細胞活性將會受到影響，這種影響屬于溶質性損害。如果冷凍速度偏快，細胞內部的冰晶也會受到一定影響，直接影響融化速度。兩種凍存方法比較發現，慢凍方法的細胞復蘇率大于快凍方法的細胞復蘇率，復蘇率見表1。

由表1可知，凍存方法不同，細胞復蘇率也呈現一定變化，雖然本次試驗分為4組，但通過橫向對比可以看出，不論哪組都可以很好地證明慢凍方法的細胞復蘇效果更好。這也很好地詮釋了凍存、復蘇之間的關系。

表1 兩種凍存方法的復蘇率 %

三、討論

在細胞體外培養中，為了試驗實際操作，需要長期保存細胞的生物活性，細胞凍存與復蘇是經常使用的試驗操作。細胞凍存復蘇后的狀態與凍存保護劑的種類、凍存時間、凍存方式、細胞復蘇方法等有關，也與各種生物學試驗結果有關。

試驗采用兩種不同的冷凍方法，即慢凍方法和快凍方法，結果發現，慢凍方法冷凍后細胞復蘇率較高。也有研究發現，兩種方法之間的過渡方法凍存復蘇后，細胞復蘇率高于其他兩種凍存方法，這可能與試驗材料、試驗方法有關。

因此，在細胞復蘇過程中對溫度控制和觀察力度都要格外注意，因為溫度變化會影響解凍速度，觀察的敏銳性可以很好地進行調整。因此，需要思考如何在不影響細胞質量的前提下進行緩慢解凍，既可以保證細胞復蘇的進程，同時又可以很好地控制細胞損傷度，雖然存在一定難度，但只要協調就可以很好地為細胞庫建立和細胞活性保持提供更強的后盾。

◎圖1 傳代1天的睪丸間質細胞（100×）

◎圖2 傳代3天的睪丸間質細胞（100×）