子癇前期患者外周血及胎盤組織中Amphiregulin表達水平及與妊娠結局關系

劉紅梅 劉曉玲 潘明霞 鐘 麗

青島婦女兒童醫院(266000)

子癇前期是妊娠期高血壓疾病的一種形式[1]，影響3%～7%的妊娠結局，可導致母嬰死亡[2]。其確切病因尚不明確，遺傳易感性、炎癥反應、胎盤缺血缺氧以及血管內皮損傷已被報告為相關因素[3]。表皮生長因子(EGF)是參與正常細胞生長和分化的促有絲分裂蛋白，表皮雙調蛋白(Amphiregulin)結合EGF樣生長因子，是EGF配體[4]。Amphiregulin是胎盤、卵巢、睪丸、心臟、胰腺、脾臟、骨髓、血液、腎、肺、結腸和乳腺等眾多器官和組織中分泌的EGF配體[5]。Amphiregulin通過結合EGFR激活多種信號級聯反應，參與細胞存活、增殖等生理過程[6]。據報道，在炎癥和腫瘤條件下Amphiregulin表達量減少[7]。目前，尚未見Amphiregulin在子癇前期中的相關研究報道，因此本研究探討子癇前期患者外周血和胎盤組織中Amphiregulin表達水平及與妊娠結局的關系，為子癇前期的診斷及治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年6月-2020年9月本院收治的子癇前期孕婦203例，根據病情分為子癇前期輕度102例、重度101例。納入標準：①符合子癇前期診斷標準[8]；②單胎妊娠，剖宮產分娩；③患者及家屬知情同意。排除標準：①內分泌疾病；②年齡18～45歲；③原發性高血壓。同期產前檢查健康孕婦108例為對照組。子癇前期重度診斷標準：在沒有蛋白尿情況下，存在以下任何一種情況，即重度高血壓(未服用降壓藥情況下休息后，收縮壓160mmHg或舒張壓≥110mmHg)、血小板減少癥(血小板計數<100000/ml)、肝功能受損(肝轉氨酶增加兩倍)、腎功能不全(血清肌酐升高>1.1mg/dl或加倍在沒有其他腎臟疾病的情況下血清肌酐升高)、肺水腫、新發腦或視力障礙。本研究遵循赫爾辛基宣言的原則，獲得機構倫理委員會的批準，參與者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1胎盤收集剖宮產中獲取胎盤，除去胎盤厚度的立方體部分(3.0cm×3.0cm)，收集從基底到胎盤內部區域的絨毛膜表面,磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌去除表面血液，將樣品在液氮中速凍，-80°C保存。

1.2.2AmphiregulinmRNA檢測采用實時熒光逆轉錄法(RT-PCR)。使用 UNlQ-10 Column TRIzol總RNA分離試劑盒(Sangon Biotech Co.Ltd.)分離胎盤、血清組織總RNA，使用 PrimeScriptTMRT 試劑盒(Takara Bio, Inc)逆轉錄為 cDNA。使用條件：30s 95℃，5 s 95℃、34 s 60℃、15 s 95℃和1min 50℃的50個循環。Amphiregulin基因特異性引物從PrimerBank獲得，引物序列：Amphiregulin正向，5'-TCGATCGATCGATCGATCGGGGCTAG CTAGCTAGCTAGCTA GTCG-3'和反向，5'-TGGCGATCGATCGATCGATCGATCGTAGCTAG CTAGCTAGCTAGCC-3'。β-actin為內參基因，引物序列為正向，5'-TCGGGCCTAGCTAGCT AGCTAGCTAGGGCTAGCTAGCTGATCGTGT GC-3'，反向，5'-TGGTCGATCGATCGATGCTAGCTAGTCGATCGATCGTAGCTAGCTA GTCGATCG-3'，使用2-ΔΔCq方法計算差異表達。數據表示為3個獨立實驗的平均值±標準差。

1.2.3Amphiregulin蛋白水平酶聯免疫吸附法測定(ELISA)。Amphiregulin(Shanghai Sunred Biological Technology)。在MK-3 Multiskan FC酶標儀(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)450nm波長下測定樣品吸光度(ng/ml)。Amphiregulin試劑盒測定內方差系數(CV)、測定間CV、檢測范圍和靈敏度分別報告為<10%、<12%和0.08～24ng/ml和0.076ng/ml。

1.2.4Amphiregulin蛋白免疫組化測定在4μm厚的石蠟包埋的前列腺組織切片上進行Amphiregulin(1:200，610153，BD Biosciences，San Jose，CA，USA)蛋白免疫組化測定。組織切片均行微波抗原修復預處理，使用Dako REALTMEnVision試劑盒(Dako, Carpinteria, CA, USA)檢測。3-氨基-9-乙基咔唑(Immunotech，Foster City，CA，USA)用作色原并用Mayer's蘇木精(Dako)復染。陰性對照染色在不應用一抗的情況下進行。Amphiregulin核表達通過評估染色強度≥10%的細胞中陽性情況下評分：0，無染色或≤10%陽性；1，弱染色；2，中度染色；3，染色性強，1～3為陽性表達。

1.3 妊娠結局評估

記錄子癇前期患者產后結局，包括胎盤重量、新生兒出生體重及1min Apgar評分。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 兩組一般情況比較

表1可見，病例組舒張壓和收縮壓均高于對照組(P<0.05)，兩組年齡、體質指數(BMI)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等無差異(P>0.05)。

表1 兩組一般情況比較

2.2 各組血清、胎盤Amphiregulin表達比較

血清及胎盤Amphiregulin mRNA、Amphiregulin 蛋白表達水平子癇前期重度組、子癇前期輕度組、對照組均依次升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組不同標本中Amphiregulin表達比較

2.3 Amphiregulin免疫組化陽性率比較

Amphiregulin主要定于細胞膜和細胞質，呈黃色或深棕黃色顆粒，Amphiregulin陽性為細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒；Amphiregulin陽性率子癇前期重度組、子癇前期輕度組、對照組逐漸升高(P<0.05)。見表3、圖1(1938頁)。

表3 各組Amphiregulin免疫組化陽性率比較[例(%)]

2.4 子癇前期嚴重程度與Amphiregulin表達相關性

子癇前期嚴重程度與胎盤及血清Amphiregulin mRNA、蛋白表達水平均呈負相關(r=-0.674、-0.601、-0.596、-0.587，P=0.001、0.015、0.004、0.009)。

2.5 各組孕產婦妊娠結局比較

胎盤重量、新生兒出生體重、1min Apgar評分在子癇前期重度組、子癇前期輕度組、對照組依次升高(均P<0.05)。見表4。

表4 各組妊娠結局比較

2.6 孕產婦Amphiregulin與妊娠結局相關性

表5可見，血清、胎盤Amphiregulin mRNA及蛋白與胎盤重量、新生兒出生體重、1min Apgar評分呈正相關(P<0.05)。

表5 孕產婦Amphiregulin表達水平與妊娠結局相關性

3 討論

研究表明Amphiregulin相關基因和蛋白質在癌癥和心血管疾病的發病機制中起著關鍵作用。該途徑的核心是在腫瘤抑制因子處啟動的激酶級聯反應Hippo對其下游效應器，即癌蛋白Amphiregulin/TAZ。與非妊娠子宮內膜的子宮內膜基質細胞(ESC)相比，妊娠蛻膜細胞中Amphiregulin的表達更高。低Amphiregulin水平通過調節CDX2來調節滋養細胞侵襲和凋亡，從而促進子癇前期的發展[9]。因此Amphiregulin可能在子癇前期的病理生理學中起關鍵作用。

研究表明，Amphiregulin在人類妊娠期間由合體滋養細胞表達，并刺激人絨毛膜促性腺激素分泌。在嗜鉻細胞瘤、產生皮質醇的腎上腺皮質腺瘤、神經節神經母細胞瘤和神經母細胞瘤的腫瘤組織中均有Amphiregulin mRNA表達。Amphiregulin對腎上腺分泌醛固酮、皮質醇和兒茶酚胺有刺激作用，導致血壓升高[10]；Amphiregulin通過與EGFR結合促進細胞滋養層細胞的生長；通過自分泌或旁分泌途徑激活細胞存活的信號級聯導致子癇前期中胎盤床和絨毛外滋養層細胞凋亡增加[11]；Amphiregulin通過激活EGF/EGFR/SOS1通路抑制p53凋亡刺激蛋白，導致肝癌細胞的凋亡抵抗[12-13]。因此，Amphiregulin水平降低會導致細胞凋亡增加，由于滋養細胞增殖和存活的減少以及細胞凋亡的增加，Amphiregulin的減少可能在子癇前期的發病機制中起作用[13-14]。EGF-Amphiregulin復合物可能具有雙重作用，即早期滋養細胞增殖和晚期滋養細胞分化，從而有助于控制胎盤生長[15]。國外研究報道與非子癇前期患者相比，子癇前期患者的血漿Amphiregulin水平降低，子癇前期妊娠胎盤滋養層細胞中EGF-Amphiregulin信號系統的廣泛下調，提出假設，即子癇前期中EGF-Amphiregulin信號系統的缺陷導致絨毛外滋養細胞分化不當和細胞凋亡增加[16-17]。與該研究類似，本研究發現，與對照相比，子癇前期患者的血清及胎盤Amphiregulin mRNA和蛋白表達均降低，且隨著子癇前期嚴重程度增加表達降低，子癇前期嚴重程度與胎盤及血清Amphiregulin mRNA和蛋白表達均負相關，說明子癇前期患者外周血和胎盤組織中Amphiregulin表達異常降低，且與子癇前期病情發展有關。

本研究分析了Amphiregulin表達水平與妊娠結局相關性，結果顯示血清及胎盤Amphiregulin mRNA和蛋白表達水平均與胎盤重量、新生兒出生體和1min Apgar評分呈正相關。近期一項國外研究表明，Amphiregulin水平臨界值3590pg/ml時，診斷重度先兆子癇的敏感性為67.9%、特異性為63.3%[18]。結合本研究中Amphiregulin表達與妊娠結局相關性明顯，提示臨床Amphiregulin可作為評估子癇前期患者妊娠不良結局的敏感生物學標志物。

綜上所述，子癇前期患者外周血和胎盤組織中Amphiregulin表達水平異常降低，且與子癇前期嚴重程度相關；Amphiregulin表達水平與妊娠結局相關性明顯，提示Amphiregulin可作為評估子癇前期患者妊娠不良結局的生物學標志物。