煙草靶斑病病原生物學與綜合防控措施研究進展

祖慶學 張翼飛 馮裕洋

（貴陽市煙草公司開陽縣分公司，貴州開陽 550300）

煙草靶斑病（tobacco target spot）由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起，因在煙草葉片上產生環帶狀壞死斑點而得名，最早于20 世紀初在美國煙區被發現[1]。該病害給許多國家的煙草生產造成了危害和損失[2-3]。20 世紀末，在我國還未發現有煙草靶斑病發生時[4]，煙草病理學專家談文教授就專門介紹了這種病害在國外暴發流行的情況[3]。 21 世紀初，吳元華等[5]在遼寧丹東煙區進行了煙草靶斑病的調查和系統性的鑒定工作，完成了該病害在我國的最早報道。隨后在廣西煙區病害調查過程中，在百色、河池和賀州等地的煙草上均發現了靶斑病[6]。針對我國煙草上發生的這種新病害，孫宏宇[7]就煙草靶斑病的流行條件和防治技術措施進行了專題綜述，為該病害的防控提供了指導。在這之后，吉林[8]、黑龍江[8]、云南[9]、湖南[10]等煙區也都先后發現了靶斑病，涵蓋了我國大部分煙葉生產區。 各地針對這種病害的病原學和綜合防治技術措施開展了大量富有成效的工作，積累了寶貴的經驗。

立枯絲核菌寄主范圍很廣，包括了茄科的煙草、茄子、番茄、辣椒，其他科屬的黃瓜、西瓜、葫蘆、白菜、甜菜等多種農作物以及一些種類的雜草[2，11-13]。該病原菌可以在煙草的所有生長階段侵染植株[2-3]，還可以引起苗期立枯病[7]。立枯絲核菌具有生活史比較特殊、遺傳分化比較復雜等特點[1]，且煙草靶斑病的田間癥狀還與部分葉斑病等病害存在相似性，這都給靶斑病鑒定識別和防控增加了難度。 本文從煙草靶斑病的識別鑒定、病原生物學、發生流行規律與綜合防控措施等4 個方面歸納總結了國內外煙草靶斑病的相關研究，對相關方面仍不明確的方向進行了討論與展望，以期為煙草靶斑病的快速準確識別與高效綠色防控提供指導，為我國各煙區煙葉生產工作與立枯絲核菌生物學研究等提供參考。

1 煙草靶斑病的識別鑒定

立枯絲核菌侵染葉片組織的最初病狀是形成一個直徑2~3 mm 的圓形壞死斑點，對著光線能夠呈現出網格結構[3，11]。 在適宜的條件下，部分壞死斑點會隨著病原菌侵染的加劇而擴展為5 cm 左右的大病斑，外形不規則，深褐色，具有明顯的同心輪紋狀結構。大病斑中心部分殘余葉片組織相對薄脆，容易脫落，使整個病斑如同子彈穿孔過的靶紙，因而該病得名“靶斑病”[2-3，11]。 但是，赤星病等幾種真菌性葉斑病中晚期的病狀也可以出現同心輪紋病斑，容易造成田間識別的混淆。 Shew 等[2]比較了2 種煙草葉斑病的病狀，發現靶斑病的初侵染圓斑非常明顯，即使在壞死區域進一步擴大之后也能夠看到殘留的痕跡，成為區別靶斑病與赤星病的重要依據。靶斑病壞死病斑的周圍具有一層黃色暈圈，是病原菌繼續侵染的表現[11]，該黃色暈圈在病原菌侵染初期、壞死病斑還是小圓形時期就存在，是靶斑病區分氣候斑等非侵染性病害的主要指標。在條件適宜的情況下，煙草靶斑病壞死病斑正反兩面都會被一層白色絲狀菌絲覆蓋，覆蓋的密度和范圍存在差異，是該病害的重要病征[5]。 在煙草植株上，靶斑病的發生集中在中下部葉片上，當然也會因條件適宜向上部葉片傳播，可以達到約1.5 m 的高度[14]。 另外，立枯絲核菌還可以侵染煙草幼苗的根或莖基部，造成潰瘍狀壞死、斷裂，進一步導致苗床大面積猝倒，這個類型的癥狀被歸為煙草立枯病。 煙草立枯病是該病原菌引起的另一種主要的煙草病害，該病害與靶斑病的發生既有聯系又有區別。

在光學顯微鏡下觀察煙草靶斑病產生的白色絲狀物病征，可以很清楚地觀察到立枯絲核菌粗壯的菌絲，寬度約10 μm；菌絲分枝的部位往往非常接近直角，分枝點外部有一定程度的縊縮；菌絲隔膜明顯，產生在分枝點附近，但不是在直接分枝的縊縮部位，這種“T”形菌絲分枝結構是立枯絲核菌重要的形態學鑒定指標[12]，也是靶斑病鑒定過程中顯微鏡觀察檢測的重點對象。另外，在靶斑病病斑處還能觀察到立枯絲核菌的子實體。 立枯絲核菌擔子梗的尺寸同普通菌絲接近，頂部膨大的擔子寬度可達14 μm[5]，擔子的頂端著生4 個無色長橢圓形擔孢子（4.0~5.5 μm×7.0~10.0 μm）[1]。

隨著分子生物學手段的日漸成熟，轉錄間隔區間（internal transcribed spacer，簡稱ITS）等分子標記被應用到煙草靶斑病的病原菌鑒定中，成為傳統形態學識別鑒定的重要補充[13，15]。 在此基礎上，我國的研究人員開發了一系列基于分子生物學工具的靶斑病快速檢測手段。肖艷松等[10]針對立枯絲核菌ITS 區域的特異性片段設計了引物， 使用該特異性引物，根據PCR 反應的產物條帶大小就可確定種類，節省了ITS 片段序列測定與數據庫比對的時間和成本。趙艷琴等[16]利用TaqMan 探針技術，針對立枯絲核菌的ITS 分子標記，實現了對土壤中病殘體的檢測；由于結合了實時定量PCR 技術，該檢測手段還可以對病殘體含量實現定量分析，初步揭示了靶斑病病殘體的存留規律。

2 煙草靶斑病的病原生物學

煙草靶斑病的病原菌是立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），最早由德國科學家Kühn 在1858 年描述建立。根據其有性世代擔子與擔孢子的形態結構特點，該病原菌一度被稱作瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris）[1，5]。目前，國際真菌分類系統（Index Fungorum）采用了立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）這一名字來命名該病原菌。 經過許多科學家的補充完善，Sneh 等[17]系統性地總結完善了立枯絲核菌的一系列分類特點，包括菌絲含褐色素、具有“T”形分枝結構、尖端含有多個細胞核以及桶孔隔膜等。 根據形態特點和分子標記的系統進化分析， 立枯絲核菌被歸屬到擔子菌門（Basidiomycota）雞油菌目（Cantharellales）角擔菌科（Ceratobasidiaceae）[18]。 立枯絲核菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，簡稱PDA）培養基上的菌落培養4 d 之后就會出現淺褐色，菌落周邊的菌絲有輕微的色帶，但是培養基上沒有變色的暈圈[10，19]，這也是該病原菌識別鑒定的一個指標。 人工培養基上的生長試驗結果表明，立枯絲核菌營養生長的適宜條件為常溫（25 ℃）、中性（pH 值=7）、黑暗和高濕度[20]。 立枯絲核菌可以產生深褐色菌核，人工培養基上的生長試驗發現，立枯絲核菌產生菌核的適宜條件為略偏酸性（pH 值5~7）、高濕度（相對濕度90%）和黑暗[20]。 立枯絲核菌在適宜的條件下可進行有性生殖，產生子實體。該病原菌的子實體是擔子與擔孢子，可以在葉片病斑中產生，也可以在土壤表面的營養物質中產生[3]。立枯絲核菌產生子實體的過程在人工培養條件下不太容易發生[1]，一些研究指出，培養基的堿性條件和培養環境中二氧化碳富集是立枯絲核菌完成有性生殖的關鍵[21]。

菌絲融合（hyphal anastomosis）是絲狀真菌普遍發生的現象，具有一定的遺傳物質交流的功能。 Parmeter 等[22]利用立枯絲核菌的菌絲融合現象對該類群進行了劃分，建立了菌絲融合群（anastomosis group，簡稱AG）的體系。Ogoshi[23]與Sneh 等[17]又先后對立枯絲核菌菌絲融合群的體系進一步完善，基本明確了各個融合群的范圍。病害研究中，通常采用載玻片定位融合法來觀察立枯絲核菌菌絲融合現象， 即將標準融合群菌株與待測菌株在放有載玻片的培養基上對峙培養，屬于相同融合群菌株的菌絲接觸之后，可以在顯微鏡下觀察到細胞壁溶解與細胞質融合的現象，比較典型的融合反應還包括了細胞核的流動[13]。進入21 世紀，ITS 分子標記也被應用到立枯絲核菌菌絲融合群體系區分中[15]，并且能夠與多個融合群的鑒定結果相匹配[1]，給融合群的鑒定提供了便利。另外，在部分融合群的鑒定中，一些傳統的菌絲融合不明顯的類別也可通過ITS 的序列分析進行完善[24]。González-García 等[12]結合分子標記系統發育理論更新了立枯絲核菌融合群劃分體系，對相關的劃分依據也進行了完善。

煙草靶斑病一些比較久遠的報道沒有進行菌絲融合群的劃分[11]。 開展相關的分析之后，美國煙區早期報道的幾例立枯絲核菌根據菌絲融合反應被鑒定為融合群AG-2-2[11]，后續一些研究中分離到的融合群也是這個融合群[24-25]。 最早被鑒定為融合群AG-3的立枯絲核菌是在南非煙區分離得到的煙草靶斑病的病原菌[14]。 隨后，在美國煙區也根據菌絲融合反應鑒定到了融合群AG-3[19]，并且該融合群的發生也出現了上升趨勢[26-27]。 近年來，阿根廷煙區靶斑病病原菌先后鑒定出了融合群AG-2-1[28]和AG-4[29]，具有一定的獨特性。在我國煙區，遼寧省的丹東和鐵嶺煙區分離得到的病原菌根據菌絲融合反應和ITS 分子標記被鑒定為融合群AG-3，開啟了我國立枯絲核菌融合群歸屬問題的研究[30]。 在這之后，在東北地區吉林通化煙區、黑龍江哈爾濱和牡丹江煙區[8]與西南地區云南臨滄和普洱煙區[9]，也分離得到并鑒定出了屬于融合群AG-3 的立枯絲核菌菌株，確定了這一融合群在我國分布范圍廣泛。除此之外，我國煙區也有其他融合群的報道。廣西壯族自治區百色、河池和賀州煙區分離得到的引起靶斑病的立枯絲核菌，經過與標準菌絲融合和ITS 序列分析發現，屬于融合群AG-2-2 和AG-4，這2 種融合群在我國其他地區還沒有被報道[6，31]。

3 煙草靶斑病的發生流行規律

煙草靶斑病具有潛育期短、流行速度快的特點，在環境條件適宜時可以反復侵染、大面積傳播，造成嚴重危害[5]。 立枯絲核菌主要在土壤中完成越冬。 根據目前的研究，立枯絲核菌在土壤中的殘留可歸納為3 種形式。 一是立枯絲核菌寄主范圍較廣[12，20]，除了煙草外，還有多種煙草產區常見的農作物和煙田周邊容易出現的雜草等可以作為立枯絲核菌的寄主，使其完成越冬存留的過程。 二是立枯絲核菌在不利環境條件下可以產生結構堅固、抗逆性強的菌核結構，能在土壤中存活比較長的時間。三是立枯絲核菌也可營腐生生活，直接利用土壤中的有機質存活[1]。Gutierrez 等[32]研究發現，栽種過前茬感病煙株的器皿約84%存在立枯絲核菌的病殘體，其中約63%的器皿病殘體可以存活1 年，這些病殘體主要包括了休眠菌絲和菌核，平均殘留深度約為1 cm。存活下來的休眠菌絲和菌核在條件適宜的情況下可于土壤表面或者病殘體周圍發育出子實體，產生擔孢子，完成侵染循環的初侵染過程。

立枯絲核菌侵染煙草葉片主要是采取直接侵入的方式。 首先，擔孢子在煙草葉片表面萌發，產生一根芽管和吸器，穩定地附著到葉片表面。 然后，立枯絲核菌突破煙葉表面的角質層和表皮組織的細胞壁，侵入表皮組織細胞中，并形成一團具有不同形狀和大小的侵染體[12]。 在這個過程中，立枯絲核菌會產生大量蛋白酶、幾丁質酶、糖苷酶和磷脂酶等胞外水解酶，協助直接侵入過程[33]。 立枯絲核菌的菌絲直接從氣孔侵入的過程也被觀察到[25]。在田間人工接種立枯絲核菌擔孢子的試驗表明，煙草葉片在侵染12 h后就可以產生初侵染病斑[34]。 立枯絲核菌的侵染體在條件適宜的情況下，會進一步向周邊組織逐步擴散：在微觀層面上，是周邊組織細胞質基質成分發生變化，導致葉肉細胞壞死；在宏觀層面上，表現為葉肉組織分批壞死，最終形成同心輪紋狀壞死病斑[12]。劉欣茹等[34]開展連續觀察試驗發現，煙草靶斑病病斑從發生到最終形成穿孔需要7~8 d。煙草靶斑病病斑上發育的子實體可以產生擔孢子，完成侵染循環的再侵染過程。

國內多項研究表明，煙草靶斑病發生與發展適宜的環境條件是高濕度，其發生往往與煙區連續降雨有關。美國煙區20 世紀80 代中期靶斑病大流行，推測同前一年夏天的極端暴雨天氣存在關聯[11]。 我國遼寧煙區21 世紀初首次報道靶斑病的案例中，煙區也出現了生長季節降水多、田間相對濕度高的情況[5]。 劉欣茹等[34]在云南煙區開展的擔孢子接種試驗發現，擔孢子在相對濕度100%的情況下可以很快地完成侵染過程。 曹哲銘等[35]在吉林煙區開展了靶斑病流行規律分析，通過使用數學模型擬合病情指數隨時間發展的變化趨勢發現，體現病害較快增長的邏輯斯蒂模型（logistic model）最符合靶斑病的發生規律。根據相關系數分析，吉林煙區5 月和6 月的降雨量和濕度是影響靶斑病流行最重要的指標。

4 煙草靶斑病的綜合防控措施

美國煙區開展的大批量煙草種質資源篩選試驗表明，煙草對立枯絲核菌的抗病性有限，可以選用的抗病品種不多[36]，因而農業防治是病害綜合防控的重要組成部分。目前，國內外主要的煙草種植產區均進行煙苗的培育和移栽，育苗設備和基質（尤其是連續使用的設備和基質）必須經過充分消毒才能最大限度地避免病殘體的留存[32]。 土壤改良也是破壞靶斑病田間流行循環的手段[37]。 在阿根廷煙區，根據病情指數的記錄和實時定量PCR 的測定發現，使用桉樹枝條誘集、換用不發病田塊和非農業用地田塊的土壤就可以有效抑制靶斑病的發生。 這個現象可能與土壤中有機質與拮抗細菌的含量相關[38]。

化學農藥的使用仍然是煙草靶斑病最為有效的防控方式[1]。 孫宏宇[7]在我國煙草靶斑病開始被發現時就專題綜述了國外已經開展的一些化學防治技術。在這之后，我國遼寧煙區也開展了許多藥效試驗，取得了大量成果。 國內煙草靶斑病被報道之后，伏 穎等[39]選用10 種殺菌劑進行立枯絲核菌的室內毒力測定，結果表明，烯唑醇的抑菌效果最好，其他4 種藥劑也表現出了一定的抑菌效果。 在遼寧煙區，50%腐霉利·噁霉靈800 倍液對煙草靶斑病能達到60%的相對防效，相關配方也已優化出來[40]；間隔7 d 施用2 次苯醚甲環唑·丙環唑和20%噻氟酰胺能達到70%以上的相對防效[41]。 這些藥效試驗的結果值得我國各地煙區在靶斑病防治時借鑒。

許多研究表明，一些物理防治和生物防治方法也具有良好的煙草靶斑病防控效果。在美國煙區，干熱風（70~80 ℃）處理可以達到很好的苗床消毒效果，基本能夠消除立枯絲核菌[32]。 在津巴布韋，從土壤中篩選出的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）菌株T77被擴繁之后添加到化學殺菌劑中控制苗期的立枯絲核菌[42]。 從我國遼寧煙區的植煙土壤中分離篩選到的灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）菌株S128 經過擴大發酵之后對立枯絲核菌具有同商業菌株接近的抑菌效果[43]，另一株淀粉酶產色鏈霉菌（S.diastatochromogenes）菌株TA1123 抑菌活性物質的代謝過程也得到了研究[44]。生物農藥嘧肽霉素和多抗霉素的復配液（1.8%）可以顯著抑制立枯絲核菌菌絲的生長，通過電導率測定，基本揭示了生物農藥對病原菌細胞膜通透性產生負面影響的作用機理[45]。

5 展望

煙草靶斑病于21 世紀初在我國被發現之后，在遼寧、吉林、黑龍江、廣西、云南和湖南等煙區都有發生。 在國外開展的煙草靶斑病的流行條件和防治技術措施等相關研究的基礎上[7]，我國煙區也積累了許多關于病原學與綜合防控措施的成果。目前，立枯絲核菌的侵染與傳播途徑基本明確，流行暴發所適合的高濕度條件在國內外煙區的研究成果中也吻合，極端天氣之后的預防性施藥應該是防治的重要節點。 立枯絲核菌的融合群分化具有一定的寄主傾向性[20]，目前在國內外的分布規律也不完全一致，引起煙草靶斑病和煙草立枯病的融合群也存在著一些差異[19]，成為相關領域深入研究的一個方向。另外，我國遼寧等煙區篩選出若干對靶斑病防控效果明顯的低毒殺菌劑，值得其他地區借鑒，而篩選的生防劑型成為綠色防控的重要組成部分。在煙葉生產中，靶斑病應與赤星病等其他真菌類葉斑病害統防統治。