絨毛染色體高通量分析在自然流產染色體核型分析中的應用價值

王麗 譚衛荷 紀玲華

作者單位：廣州醫科大學附屬第六醫院/清遠市人民醫院產前診斷中心，廣東 清遠 511500

自然流產是指妊娠時間在28 周以內、胎兒體重低于1 000 g，產婦自行終止妊娠。目前自然流產的發生率較高，導致自然流產的原因較多，胚胎染色體異常因素導致的自然流產占據了自然流產的一半[1]。因此，對自然流產患者流產胚胎進行絨毛染色體檢測有助于明確流產的原因。以往臨床多采取流產絨毛染色體進行核型分析，但絨毛細胞的采集和培養要求均較高，導致培養成功率和分辨率均較低，無法達到理想的檢測效果[2]。絨毛染色體高通量分析檢測避免了傳統測序技術的不足，可提高檢測敏感性和準確性，且成本較低，檢測周期較短，能夠檢測出染色體的非整倍體[3]。鑒于此，本研究旨在利用高通量測序技術檢測自然流產組織絨毛染色體，旨在為下次妊娠提供指導依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019 年1 月—2020 年12 月廣州醫科大學附屬第六醫院/清遠市人民醫院收治的812 例自然流產患者進行研究，年齡24 ～33 歲，平均（28.65±5.27）歲；流產孕周6 ～12 周，平均（9.51±1.03）周；首次流產286 例，復發性流產526 例。

納入標準：（1）超聲確認為宮內妊娠者。（2）患者知情同意。（3）無有害物質接觸史者。排除標準：（1）存在感染史者。（2）既往存在有害物質接觸史者。（3）不同意參與本研究者。

1.2 方法

1.2.1 標本準備 獲取自然流產胎盤絨毛組織10 mg，生理鹽水沖洗，待沖洗干凈后采集流產胚胎的絨毛標本。采用德國Qiagen GmbH 公司的Qiagen Blood ＆ Tissue 試劑盒提取胚胎絨毛組織的DNA。利用紫外可見分光光度計（生產廠家：上海精科上分儀電；型號：721G 722N）測定，采用10 mg/L 的瓊脂凝膠電泳（生產廠家：北京佳航博創科技有限公司；型號：HT-SUB02）對DNA 片段的完整性進行判斷。

1.2.2 高通量分析測序 采用基因測序儀（生產廠家：廣州萬德基因醫學科技有限公司；型號：NextSeq CN 500），貝瑞和康基因診斷技術，對樣本染色體拷貝數進行檢測。打斷基因組DNA 為小片段核酸，并修復末端，加“A”和接頭，再加入引物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），構建文庫。通過Q-PCR 儀（美國安捷倫2100）進行文庫質控，質控合格后，在NextSeq 550AR 平臺，按50SE 單末端10 M 數據量測序。將測序結果利用比對軟件，將每個測序標簽分別匹配至對應染色體上，以對染色體拷貝數異常進行判定。

1.3 觀察指標

1.3.1 觀察指標 比較高通量測序染色體核型分析結果。

1.3.2 評價標準 高通量分析測序結果的判定[4]：染色體非整倍體異常及結構異常為陽性。若為致病性片段時為陽性；若為多態性片段或者致病性未知時為陰性。

1.4 統計學方法

以SPSS 20.0 軟件行數據分析，計數資料以n（%）表示。

2 結果

高通量測序染色體核型分析共檢測812 例絨毛樣本，檢測成功806 例，檢測失敗6 例，檢測成功率為99.26%。絨毛染色體異常291 例，占比為36.10%，其中致病性CNV 19例，占比為2.36%；絨毛染色體未見明顯異常515 例，占比為63.90%。在291 例絨毛染色體異常樣本中，染色體數目異常為272 例，包括非整倍體為222 例，其中三體為178 例，主要涉及染色體16 號和22 號；單體為46 例，多數為特納綜合征43 例；三倍體為36 例；47，XXX 2 例，47，XXY 4 例，染色體結構異常為19 例。見表1。

表1 自然流產高通量測序染色體核型結果分析

3 討論

自然流產是一種常見的妊娠期并發癥，發病率呈不斷上升的趨勢，其中染色體異常為關鍵致病因素，約占自然流產或胚胎停育50%[5-6]。絨毛是胚胎組織的組成部分，其具有和胚胎組織相同的遺傳性狀，因此絨毛細胞所制備的染色體核型即為胎兒染色體核型。絨毛細胞及胚胎組織均是通過受精卵進行有絲分裂后而產生，絨毛細胞及胚胎組織所攜帶的遺傳信息均相同，因此絨毛細胞及胚胎組織可作為標本來檢查胚胎染色體的異常情況，從而查找到自然流產發生的病因，為臨床診治不孕不育工作提供參考依據，為胚胎停育患者的再次妊娠提供有效的遺傳信息咨詢[7-8]。

流產組織絨毛染色體檢測的方法包括染色體核型分析和高通量測序法[9]。染色體核型分析能夠檢測出46 條染色體數目異常及染色體大結構異常，但該檢測方法存在諸多的缺點，包括：（1）核型分析需對絨毛細胞進行培養，且檢測周期較長，標本質量要求高，當標本受到污染后會導致培養失敗，從而得不到正確的檢測結果[10]。（2）整個檢測流程均為人工操作，且對操作人員能力要求高，穩定性差[11]。（3）核型分析的分辨率不高，無法檢出染色體的拷貝數變異，對5%以下嵌合的檢出率較低[12-13]。絨毛染色體的細胞培養G 顯帶核型分析也存在不足之處，即培養時間較長，培養成功率受制于流產組織的新鮮程度及絨毛形態，且無法檢測出低于5 Mb 的微小染色體畸變[14-15]。

王蘭等[16]研究結果報道，高通量測序技術對流產組織行染色體核型分析顯示異常率為48.90% ；異常核型以三體型為65.17%，染色體微缺失/ 微重復次之為15.73%。本研究結果顯示，高通量測序染色體核型分析共檢測812 例絨毛樣本，檢測成功806 例，檢測失敗6 例，檢測成功率為99.26%。絨毛染色體異常291 例，占比為36.10%，其中致病性CNV 19 例，占比為2.36% ；絨毛染色體未見明顯異常515 例，占比為63.90%。在291 例絨毛染色體異常樣本中，染色體數目異常為272 例，包括非整倍體為222例，其中三體為178 例，主要涉及染色體16 號和22 號；單體為46 例，多數為特納綜合征43 例；三倍體為36 例；47，XXX 2 例，47，XXY 4 例，染色體結構異常為19 例。本研究結果與王蘭等[16]研究結果存在共同之處。結果提示：高通量分析測序能夠提高染色體結構異常的檢出率。分析原因可能為：（1）高通量分析測序可調整測序深度和覆蓋度，加強對染色體的亞端粒區域觀察，以得到準確的判定依據，可提高自然流產胚胎組織絨毛染色體異常的檢出率[17-18]。（2）高通量分析測序能夠對數十萬至數百萬個DNA 分子進行測序，最小能夠檢測10 kb 微小片段異常，且無需細胞培養，可應用于流產組織絨毛染色體檢測[19-20]。

綜上所述，高通量分析測序檢測可明確自然流產的遺傳學因素。本研究的局限性在于未進行細胞培養染色體核型分析，缺少對照研究，在接下來的研究中將繼續進行深入研究。文章的研究結果為進行細胞培養染色體核型分析提供了借鑒內容。