基于網絡藥理學和分子對接法的四物湯治療腎性貧血的分子機制研究

何爽，王喜紅，陳夢琳，張興華，唐閣*

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院腎病科，天津 300193；2.國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300193）

0 引言

腎性貧血是由促紅細胞生成素缺乏所導致的正色素正細胞性貧血，是慢性腎臟病（chronic kidney disease,CKD）的常見并發癥[1]，也是CKD患者合并心血管并發癥的獨立危險因素[2]。當腎小球濾過率降至60m L/(min·1.73m2)以下時，疾病進展速度加快，并且腎小球濾過率越低，病情越嚴重。該病多發生于CKD4-5期患者，其中CKD4期患者的發病率約為50%，終末期腎臟病患者的發病率更是高達90%以上。糾正貧血可在一定程度上降低CKD患者死亡率、住院率，同時提高患者的生活質量[3]。

近年來，隨著腎性貧血中醫病因病機的研究不斷深入，中醫藥治療腎性貧血取得了較大進展。中藥復方在治療腎性貧血方面具有多靶點、整體調治、安全性高的顯著優勢。四物湯作為補血調血的基礎方，已被廣泛應用于各種類型的貧血[4-6]。本研究基于網絡藥理學分析四物湯（組成分別為當歸、川芎、白芍、熟地黃）的有效活性成分及作用靶點，探究其治療腎性貧血的潛在作用機制，以期為后續的臨床及實驗研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 四物湯相關靶點的收集

通過中醫藥系統藥理學平臺TCMSP（old.tcmsp-e.com/tcmsp.p hp）分別檢索當歸、川芎、白芍、熟地黃四味中藥，以口服利用度（OB）≥30%，且類藥性（DL）≥0.18為標準，對有效活性成分及其對應靶點蛋白進行篩選，篩選后根據已發表的文獻補充未檢測到的靶點。完成上述步驟后在Unip rot數據庫（https://w w w.uniprot.org/）進行蛋白和基因的標準化轉換。

1.2 四物湯治療腎性貧血相關靶點的篩選

通過人類基因數據庫G e n e C a r d s（http s://w w w.genecard s.org）和人類基因和遺傳疾病數據庫OMIM（http s://w w w.omim.org），以“Renal anemia”為關鍵詞進行檢索，同時利用DrugBank數據庫（https://go.d rugbank.com）對疾病基因進行補充，去除重復項得到最終的腎性貧血相關基因，并與藥物成分的相應靶點取交集，所得到的交集基因即是四物湯治療腎性貧血的潛在作用靶點。

1.3 四物湯成分—腎性貧血靶點的PPI網絡構建

將得到的交集基因通過S t r i n g數據庫（https://string-db.org）進行生物信息分析。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建藥物有效成分—疾病—靶點的蛋白互作（PPI）的可視化網絡。

1.4 四物湯成分—腎性貧血靶點功能與通路的富集分析

將四物湯治療腎性貧血的靶點導入Metascape數據庫（https://metascape.org）進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，借助微生信（w w w.bioinformatics.com.cn）對其結果進行可視化處理，分析四物湯治療腎性貧血的潛在機制。

1.5 分子對接驗證

根據Degr ee值篩選出排名前3的核心靶點與頻次最高的3個關鍵成分，分別在PDB數據庫(http://w w w.p d b.org/)下載蛋白的3D結構、Pubchem數據庫（http s://p ubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載有效成分的2D結構，利用Auto Dock和Pymol軟件對四物湯中的主要成分和核心靶點進行分子對接，對其結合活性進行分子驗證。一般結合能越小，分子對接結果越好，當結合能≤-5 k J/mol，提示核心靶點與有效成分間的結合活性較好[7]。

2 結果

2.1 四物湯的化學活性成分與腎性貧血的相關靶點

通過對當歸、川芎、白芍、熟地黃的有效成分進行檢索，共獲得18個有效成分，分別為β-谷甾醇、豆甾醇、Mand enol、楊梅酮、黑麥草堿、川芎萘呋內酯、谷甾醇、甲酰胺、芍藥黃酮、(3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-d ihyd roxy-4,4,8,10,14-p entamethyl-2,3,5,6,7,9-hexahy d r o-1H-cy clop enta[a]p henanthrene-15,16-d ione、芍藥苷、丁子香萜、山柰酚、(+)-catechin。共獲得245個靶點，合并后4刪除重復值共得到靶點105個。通過Gene Card s、OMIM和Drugbank數據庫以“Renal anemia”為關鍵詞進行檢索，經過合并及刪除重復靶點后共獲得1834個腎形貧血相關靶點。

表1 四物湯中主要活性成分

2.2 四物湯成分—腎性貧血相關靶點PPI網絡

將篩選出的105個藥物成分靶點與1834個疾病靶點取交集，獲得36個共同靶點，韋恩圖顯示結果如下，見圖1。將共同靶點輸入至string平臺，得到四物湯治療腎性貧血靶點的PPI網絡。通過Cytoscap e 3.7.2軟件將結果根據Degree值調節進行進一步處理，得到一個具有36個節點，298條邊的可視化網絡，見圖2。

圖1 四物湯成分與腎性貧血相關靶點韋恩圖

圖2 四物湯與腎性貧血的可視化PPI網絡

2.3 靶點功能與通路的富集分析

將四物湯治療腎性貧血的靶點導入Metascap e數據庫，進行GO功能富集分析，共獲得的生物過程(Biological Process,BP)有712條，細胞組成(Cell Composition,CC)有24條，分子功能(Molecular Function,MF)有58條，按校正P值分別取BP、CC、MF排名的前10條，共計30條，主要與對細菌來源的分子的反應、對脂多糖的反應、對無機物的反應等生物功能有關，見圖3。對四物湯治療腎性貧血的靶點進行KEGG通路富集分析，共獲得126條通路，按校正P值排名取前30條通路在微生信進行可視化，其中點越大表示富集基因數越多，顏色越紅表示四物湯對腎性貧血的干預越密切，由圖可知，其機制主要與脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE等通路有關，繪圖后顯示如下，見圖4。

圖3 GO功能富集分析

圖4 KEGG通路富集分析

2.4 分子對接驗證

利用AutoDock和Pymol軟件對排名前3的活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚和排名前三的核心靶點IL-6、AKT1、TNF，分別進行分子對接。具體對接結果如下，見表2，由表2可知四物湯有效成分β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚和核心靶點IL-6、AKT1、TNF的結合能均≤-5 k J/mol，表明本研究中有效成分與核心靶點對接活性較好，可能是四物湯治療腎性貧血的主要有效活性成分；其中豆甾醇與AKT1結合力最強，其次是豆甾醇與IL-6、豆甾醇與TNF，分子對接結果見圖5。

表2 核心靶點與活性成分對接結果—最低結合能（kJ·mol-1）

AKT1與豆甾醇對接情況

IL-6與豆甾醇對接情況

TNF與豆甾醇對接情況圖5分子對接結果

3 討論

腎性貧血是CKD中后期較為常見的并發癥，亦是導致CKD患者心血管風險的獨立危險因素。目前臨床上主要使用促紅細胞生成素（erythrop oietin,EPO）或EPO類似物，但可能誘發心血管事件、高鉀血癥和感染等并發癥，并增加死亡風險[8]。中藥在改善腎性貧血的臨床癥狀方面有極大潛力。賈梅等[9]在實驗中證實四物湯可改善小鼠的外周血象、免疫器官指數及紅細胞膜能量代謝酶活力，起到較好補血的作用。在腎性貧血的臨床研究中，梁同衍等[10]證實四物湯不僅可升高維持性血液透析患者的血紅蛋白水平，亦可降低C反應蛋白、IL-6水平，即改善患者的微炎癥狀態，從而間接發揮改善腎性貧血的作用。

本研究通過網絡藥理學篩選得到四物湯18種有效活性成分，其中β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚可能是發揮防治腎性貧血作用的關鍵成分。CKD患者中后期常伴有不同程度的貧血，炎癥反應是CKD患者貧血加重的獨立危險因素[2]，而β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚均具有抗炎作用[11-13]。炎癥反應時鐵代謝紊亂，巨噬細胞內鐵滯留，最終導致紅細胞半衰期減少，EPO功能和紅細胞祖細胞分化受抑制[14]。豆甾醇可通過降低炎癥因子IL-1β和TNF-α水平，升高抗炎因子IL-10水平，以達到抗炎，減輕貧血的作用[12]。山柰酚可通過增加巨噬細胞數量，抑制脂多糖（LPS）誘導的TNF-α和IL-1的表達，抑制TNF-α介導NF-κB p65向細胞核的易位，起到抗炎作用，進而減輕貧血的作用[15]。β-谷甾醇在抗氧化方面的治療具有較大潛力，可顯著降低谷胱甘肽過氧化物酶和Mn超氧化物歧化酶活性，減緩紅細胞老化，從而起到減輕貧血的作用[16,17]。上述關鍵成分均可通過抑制炎癥反應，發揮減輕貧血的作用。另有研究顯示，β-谷甾醇是一種植物固醇，可通過抑制促炎細胞因子、TNF-α的分泌，同時激活抗炎細胞因子，進而發揮抑制EPO細胞凋亡，減輕腎性貧血發生的作用[16,18]。

從靶點角度考慮，IL-6、AKT1、TNF在PPI網絡中處于核心位置，可能是四物湯治療腎性貧血的核心作用靶點。四物湯中大多數活性成分作用于靶點IL-6。該成分可通過誘導肝素導致紅細胞生成中的鐵供應減少，促進腎性貧血的發展[19]。一項實驗研究得出IL-6導致貧血的機制或與肝素的激活、腎纖維化的加重、EPO軸的改變和紅細胞破壞的激活有關，并提出有必要對IL-6進一步研究[20]。TNF是機體的另一重要炎性因子，當其升高時亦可加重炎癥反應，進而促進貧血的發生、發展[21]。CKD患者長期處于微炎癥狀態，分析可知，此狀態是貧血加重的原因之一。AKT是PI3K/AKT/m TOR信號通路的樞紐，此通路廣泛參與干細胞的代謝、生長、增殖和存活，與造血干細胞密切相關[22,23]。分子對接結果表明主要活性成分與關鍵靶點結合較強，親和力較好，進一步驗證了此次研究的可靠性。

通過對GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的結果可知，GO功能富集結果顯示四物湯治療腎性貧血的機制主要與刺激反應、氧化應激等生物過程有關。KEGG通路富集結果顯示四物湯治療腎性貧血的機制主要與調控脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE等信號通路有關。脂質和動脈粥樣硬化通路是慢性腎衰竭合并心血管風險的主要因素，心血管疾病可加快CKD進展，進而加重貧血，即脂質和動脈粥樣硬化通路可間接導致貧血的發生[24]。AGERAGE信號通路可通過誘導腎小球硬化和間質纖維化來加快CKD進展，進而增加貧血的發生率[25]。此外，炎癥是腎性貧血發生、發展的重要原因，AGE-RAGE信號通路與炎癥密切相關，四物湯中的有效成分可通過調控此通路激活的炎癥通道，抑制炎癥反應，達到改善貧血的作用[26]。因此，推測四物湯通過調控脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE等信號通路，作用于IL-6、AKT1、TNF等核心靶點而發揮治療腎性貧血的作用。

綜上，研究結果表明四物湯治療腎性貧血具有多成分、多靶點、多通路的特點。本研究基于網絡藥理學的方法，從分子水平初步探討四物湯治療腎性貧血的主要有效活性成分、關鍵靶點及信號通路，初步闡述四物湯治療腎性貧血的作用機制，為臨床治療腎性貧血提供理論依據，也為中藥復方治療腎性貧血提供新的方法和思路。本研究還存在一定的局限性，研究結果僅僅基于生物信息學與數據計算的結果，初步解釋四物湯治療腎形貧血的機制，并未進行相關的動物、細胞實驗；其次，數據庫數據尚不完善、更新周期較長。為了進一步驗證此結果，還需要大量的基礎研究。