病毒誘導的基因沉默技術研究進展

康立茹，王 永，楊永峰，高 婧，董 婧，王黎勝，劉 燕*

(1.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，內蒙古 呼和浩特 010031；2.烏拉特中旗水利局，內蒙古 烏拉特中旗 015300；3.烏海市農業(yè)發(fā)展中心，內蒙古 烏海 016000;4.呼倫貝爾市農畜產品質量安全中心，內蒙古 呼倫貝爾 021000)

隨著許多作物全基因組測序工作的完成，從反向遺傳學角度，即根據(jù)已知序列克隆相關基因，利用生物技術從基因缺失和基因獲得兩個互補的方面研究基因的功能，已經(jīng)成為近年來基因功能研究的主要策略。這一策略的基礎大多是要蛋白組或者轉錄組等高通量測序技術結合生物信息學的分析，首先獲得不同時間點、不同植物組織等處理下基因的表達譜，篩選出與處理直接相關的目標基因，再進行功能驗證。

1 VIGS 技術的機制及發(fā)展

病毒誘導的基因沉默技術 （VIGS,Virus-induced gene silencing）正如字面意思一樣，病毒作為異源的核酸，在其侵染植物時，會被植物識別，而后啟動一系列的調控機制來降解病毒的RNA。 研究人員根據(jù)這一原理，改造病毒載體，使其攜帶目的基因cDNA 后侵染植物，病毒RNA 在復制過程中會與植物轉錄后自身的RNA 配對形成雜合的雙鏈RNA（double stranded RNA, dsRNA），植物細胞會識別這種錯誤的dsRNA，并啟動特異性核酸內切酶Dicer 類似物對其進行切割，最終形成21～23 nt 大小的小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）[1]，siRNA、 植物靶基因翻譯后形成的單鏈 RNA、Agronaute1（AGO1）蛋白等結合形成RNA 誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）[2]，最終通過特異性降解轉錄過程中的靶基因的RNA 序列而達到基因沉默的目的，屬于轉錄后水平的基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）[3]。

病毒作為VIGS 技術中的重要載體，最早科研人員主要圍繞RNA 病毒進行研究，涉及作物主要有本氏煙、 番茄等。 Kumagai MT 用煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）作為侵染載體，使其攜帶PDS 目標基因cDNA 反義鏈，侵染煙草后，葉片出現(xiàn)白化。自此以后大量的研究都證明了煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV） 是植物病毒中寄主范圍最廣的病毒，可以對50 多個雙子葉和單子葉植物中的400 多個品種造成侵染，當然很多寄主侵染而不引起癥狀。TRV 病毒作為VIGS 載體的體系不斷探索和建立，Ratcliff F 等[4]證明了TRV 可以用于本氏煙中基因功能研究，可造成系統(tǒng)侵染，且不會造成病毒癥狀；Liu Y 等[5]利用TRV 病毒載體成功侵染番茄植株，致使番茄中PDS、CTR1 和CTR2 三個基因沉默，同時該病毒還可侵染番茄果實，導致基因沉默[6]；Chung E[7]首次用TRV 侵染辣椒葉片，PDS 沉默后葉片出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，證明了該技術可用于辣椒中基因功能研究；此外該技術同樣成功應用在矮牽牛[8]、草莓[9]等作物中。

病毒誘導的基因沉默技術中應用的病毒載體除了煙草脆裂病毒TRV 以外，另外涉及的病毒載體還有很多，如Ruiz MT 等構建帶有本氏煙PDS 基因cDNA 序列的馬鈴薯X 病毒 （potato virus X,PVX）[10]載體，侵染煙草后植株出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，并能造成系統(tǒng)性基因沉默。 Faivre-Rampant O 等[11]研究表明，PVX 可誘導二倍體和四倍體馬鈴薯中的PDS 基因沉默而使馬鈴薯葉片出現(xiàn)光漂白的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在多代擴繁的組培苗和微型薯塊中都可觀察到。此外豌豆早枯病毒（Pea early browning virus，PEBV）[12]、大麥條紋花葉病毒（Barley stripe mosaic virus，BSMV)[13]等VIGS 載體均被研究和應用，突破VIGS 技術因作物種類和病毒類型所限，而被廣泛應用于多種作物對相應處理中某個或某些基因功能的研究中。

2 VIGS 技術在植物抗病基因功能研究中的應用

根據(jù)目前報道，VIGS 是鑒定植物基因功能的主要工具，應用領域涉及番茄、茄子、棉花、黑麥、小麥等多種植物的抗病基因、代謝和發(fā)育相關基因、逆境脅迫，還有花色花香相關基因的研究工作，其中植物抗病基因功能研究是應用最多的領域之一。

黃賽花等[14]利用VIGS 技術對大豆抗大豆花葉病毒（SMV）候選基因Gm Z15 進行功能分析，認為該基因正向調控大豆對SMV 的抗性。 石嶸[15]分析油菜與黑莖病菌互作的轉錄組數(shù)據(jù)，得到抗病相關基因WRKY70 和LRR-RLK，并利用VIGS 技術進行了功能驗證，認為基因沉默后植株葉片病斑面積變大，褪綠發(fā)黃更明顯。李雪瑩[16]利用TRV-VIGS 技術研究了CmWRKY15-1 基因在菊花抗白色銹病中的功能，證明了CmWRKY15-1 基因沉默后會抑制SA 通路相關基因的表達，也參與SA 合成，從而調控菊花對白色銹病的響應。Zhou X 等[17]將VIGS 技術應用于番茄抗病基因中功能的研究中，沉默掉SlTPR2 和SlTPR4兩個基因后，植株更感病。

就VIGS 技術在馬鈴薯中的應用來講，相關研究主要有，2001 年Takken 等[18]利用灌根法成功沉默馬鈴薯PB7 基因，并在接種后20 d 左右觀察到癥狀。2004 年，F(xiàn)aivre-Rampant O 等[19]利 用 馬 鈴 薯X 病 毒（PVX）作為VIGS 載體，在四倍體和二倍體馬鈴薯組培苗中成功沉默PDS 基因，白化癥狀可以在無性繁殖中連續(xù)多代存在，并且在微型薯中也可觀察到。 隨后張曉蘿[20]優(yōu)化了VIGS 技術在馬鈴薯中的接種方法，并比較了品種差異對VIGS 效率的影響，同時利用該方法證明了StRac 基因在馬鈴薯抗晚疫病過程中是正向調控因子。 田再民[21]也用VIGS 方法研究馬鈴薯StRab5b、StRab 兩個基因在抗晚疫病中的功能，基因沉默后葉片病斑面積更大。

VIGS 技術在植物與黃萎病互作基因功能研究中的應用也有大量報道，在棉花抗黃萎病相關基因 GhVe1、GbVe1、G hNDR1、Gb CAD1、GhMKK2、GhBAK1、GhEDS1、GhSKIP35 和 GhMLP28、GhB2、GbCRK18 等[22-24]，經(jīng)過驗證有些基因沉默后植株抗性增加，也有些基因沉默后會使植株抗性降低，即基因調控棉花對大麗輪枝菌的抗性呈正負兩個方向。當然，相關研究主要集中在棉花這種作物上，關于馬鈴薯與黃萎病互作基因功能的研究未見報道。