NRG2通過調控PI3K-AKT 通路促進創面修復相關巨噬細胞的M2 極化

彭友華，李婧林，張予晉，周蓉，潘 意，高貴云

(1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院皮膚科，湖南長沙，410005；2 .湖南航天醫院皮膚科，湖南長沙，410221)

皮膚是人體表面積最大的器官，也是保護機體內部組織免受機械損傷、微生物感染和紫外線輻射等外部傷害的屏障。皮膚損傷后，過度的炎癥反應、機體狀況差、并發糖尿病等原因往往阻止創面的修復過程，導致創面愈合延遲甚至創面不愈[1]，給患者心理和生理帶來沉重的負擔。神經調節因子（neuregulins,NRGs ）是一個由4種基因編碼的家族，是一種生長因子，具有協調細胞分化、軸突生長、髓鞘形成和突觸形成等重要功能，還可通過直接調節神經元興奮性、神經傳遞和突觸可塑性，促進神經系統發育，對成人大腦的功能起著至關重要的作用[2]，在多種心血管疾病中也扮演保護性和修復性生長因子的角色，在創面修復過程同樣存在有利作用[3]。

已有研究證實，巨噬細胞是創面修復過程中調控炎癥反應的關鍵細胞。循環單核細胞可遷移至創面損傷部位分化為巨噬細胞，促進血管生成、膠原沉積及細胞增殖，進而促進創面修復進展[4]。巨噬細胞的表型及功能還可通過創面微環境的變化發生改變，與中性粒細胞為主的其他細胞共同作用，完成創面修復過程[5]。本研究通過生物信息學分析獲得巨噬細胞相關的創面修復關鍵因子，驗證NRG2在創傷修復相關基因芯片的表達情況，進而通過細胞實驗，探討其在創面修復過程中發揮作用的具體機制，為創傷修復提供新的科學依據。

1.材料與方法

1.1 生物信息分析

在GEO 數據庫中下載創傷修復相關基因芯片GSE157291，比較皮膚創面愈合早期和晚期傷口巨噬細胞轉錄組。檢測平臺為GPL18480。將normalized counts 標準化后的矩陣進行limma 差異分析，篩選出差異表達基因（log2FC >0.4,FDR<0.05）。

1.2 實驗動物與細胞

6只SPF清潔級8～12周齡雄鼠，體重25～30g，購于湖南斯萊克景達公司。嚴格按照國家動物飼養規則飼養一周后進行實驗。本研究經醫院動物倫理委員會批準。

人THP-1細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 試劑

RPMI-1640培養基購自Gibco公司；CD80、CD86、CD163、CD206抗體購

自聯科生物技術股份有限公司；cDNA反轉錄試劑盒、RT-qPCR 檢測試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成；BCA 試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；ECL 發光液購于杭州弗德生物科技有限公司。

1.4 構建小鼠皮膚創面模型

在腹腔中注射10%的水合氯醛對小鼠進行麻醉，剃去小鼠背部的毛發，面積約為3cm×3cm 。使用無菌手術剪將去直徑約為5mm 的圓形皮膚，傷口深至筋膜，觀察造模后、造模后第3d、造模后第6d及造模后第13d 的創面情況，并將觀察造模后、造模后第3d 定義為創面修復早期組，造模后第6d及造模后第13 d定義為創面修復晚期組。

1.5 細胞培養

5% CO2，37℃條件下，使用RPMI-1640（10%FBS0.05mM β‐mercaptoethanol1% P/S ）培養基培養THP-1細胞。

1.7 數據分析

本實驗數據由GraphPad 處理，最終數據由三次獨立實驗結果的平均值±標準差表示。統計顯著性采用LSD-t 檢驗，P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 創面修復相關GEO芯片篩選DEGs

基于數據集GSE157291，分析比較皮膚創面修復早期和晚期巨噬細胞的轉錄組，獲得663個在創面修復晚期上調的DEGs及444個在創面修復晚期下調的DEGs，NRG2在創面修復晚期顯著上調。見圖1。

圖1 創面修復相關GEO 芯片篩選DEGs A: DEGs 熱圖 B：基因芯片中NRG2 的表達水平

2.2 NRG2在創面修復過程中的表達水平

構建小鼠皮膚創面模型，觀察小鼠皮膚外觀形態。qPCR及western blot 檢測NRG2在小鼠不同創面修復階段中的表達水平。結果顯示，創面修復早期，小鼠創面存在膿性分泌物，表皮修復不明顯；創面修復晚期，小鼠創面無膿性分泌物，創面面積明顯縮小，出現明顯的愈合趨勢。與創面修復早期比較，創面修復晚期小鼠NRG2 mRNA 及蛋白水平顯著上調。見圖2。

圖2 NRG2 在創面修復過程中的表達水平 A：小鼠創面外觀形態；B：qPCR 檢測 NRG2 在小鼠中的表達水平；C:western blot 檢測 NRG2 在小鼠中的表達水平

2.3 NRG2促進巨噬細胞M2極化

構建NRG2過表達質粒，將NRG2過表達質粒（NRG2組）及對照質粒（vector-NC 組轉染至巨噬細胞，通過qPCR及western blot 檢測轉染效率。并通過流式細胞術實驗檢測NRG2對巨噬細胞極化的影響。結果顯示，NRG2過表達質?？稍诩毎谐晒崿FNRG2的過表達。見圖3。與vector-NC 組相比，NRG2組的CD80、86標記的M1巨噬細胞百分率顯著降低，CD163、CD206標記的M2巨噬細胞百分率顯著升高，即NRG2促進巨噬細胞M2極化。見圖4。

圖4 NRG2 過表達對巨噬細胞 CD80（M1 型）、CD86（M1 型）、CD1636（M2 型）、CD206（M2 型）的影響

2.4 NRG2通過介導PI3K-AKT 通路促進巨噬細胞M2極化

將NRG2過表達質粒（NRG2組）及對照質粒（vector-NC 組）轉染至巨噬細胞，并使用PI3KAKT 抑制劑LY294002進行干預。使用Western blot 法檢測p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白表達水平；并通過流式細胞術實驗檢測巨噬細胞表型。結果顯示，與vector-NChibitor-NC 組相比，NRG2組細胞p-PI3K、p-AKT 表達水平及，CD163、CD206標記的M2巨噬細胞百分率均顯著上調，CD80、86標記的M1巨噬細胞百分率顯著降低。PI3K-AKT 抑制劑LY294002抵消了NRG2的促進作用，即NRG2通過介導PI3K-AKT 通路促進巨噬細胞M2極化。見圖5、6。

圖5 NRG2 調控 PI3K/PI3K-AKT 通路

圖6 NRG2 通過介導PI3K-AKT 通路促進巨噬細胞M2 極化

3 結論

NRGs是由四個亞型組成的表皮生長因子（epidremai growth factor,EGF ）家族，在人體各組織中廣泛表達。研究發現,NRGs 可通過旁分泌、近分泌等方式激活下游通路，參與脊髓、心肌等組織受損的修復過程[3,6]，在皮膚創面修復過程中，也發揮重要作用[7]。創面修復是一個涉及細胞、細胞因子及細胞外基質相互作用的復雜動態過程，在影響創面修復的免疫細胞中，巨噬細胞被認為是促進炎癥增殖階段的關鍵因素，通過調控炎癥反應、細胞增殖和遷移以及血管的生成過程對傷口修復至關重要[8]。因此，本研究通過生物信息分析與創面修復相關的巨噬細胞中的差異表達基因，發現NRGs家族中的NRG2表達存在顯著差異，因此，選擇NRG2進行后續研究，以期探究其在創面修復中發揮作用的具體機制。

創面修復相關的巨噬細胞可分為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞，M1型巨噬細胞可通過分泌炎癥因子促進過度的炎癥反應，阻礙創面修復進展，而M2型巨噬細胞通過分泌抑炎因子以抑制創面修復過程中的炎癥反應，且其還可以分泌生長因子，利于創面修復進程[9]。本研究通過構建NRG2過表達質粒并轉染至THP-1細胞，流式細胞術檢測巨噬細胞極化情況，發現NRG2能夠顯著促進巨噬細胞的M2型極化，證實NRG2通過調控巨噬細胞M2極化在創傷修復中發揮作用。研究發現，PⅠ3K/Akt 通路可調節巨噬細胞的存活、遷移和增殖，還可協調巨噬細胞對不同代謝和炎癥信號的反應[10]，此外，PI3K/AKT 通路在調節巨噬細胞M2極化方面也發揮重要作用[11]。而NRG激活后可進一步激活PI3K，進而介導PⅠ3K/Akt 通路[12]。本實驗將轉染NRG2過表達質粒的THP-1細胞與PI3K-AKT抑制劑LY294002共同干預，實驗結果與上述研究一致。證實了NRG2通過介導PI3K-AKT 通路調控巨噬細胞M2極化，在創傷修復過程中發揮作用。

綜上所述，NRG2可通過介導PI3K-AKT 通路調控巨噬細胞M2極化，進而促進創面修復過程。