遺傳性易栓癥基因診斷的研究進展

余 晴, 方寶枝, 呂明恩

(南京醫科大學附屬蘇州醫院/蘇州市立醫院 血液科, 江蘇 蘇州, 215002)

遺傳性易栓癥是指機體內存在某種基因缺陷而導致相應的蛋白含量減少或者功能異常，以及凝血因子的濃度升高，造成血栓形成風險增加。基因缺陷獨立存在時可無臨床表現，但合并獲得性復雜高危因素時，可使血栓嚴重程度與常規檢測結果不匹配。中國人群易栓癥檢測主要有表型檢測和基因檢測2種方式，但表型檢測易受外在因素(急性血栓形成期、抗凝藥物、感染、妊娠、激素等)的干擾，經多次復測才可能明確診斷，而基因檢測便捷、準確，在任意時間進行2次測序即可[1]。2018年，瑞金醫院對292例靜脈血栓形成患者及其近700名家系成員進行基因檢測，突變檢出率達到60.6%, 在指導制訂個性化診療方案中具有很好的臨床應用效果[2]。因此，對于實驗室常規篩查也不能完全明確異常部位血栓病因且有家族史的年輕患者，早期進行基因檢測有益于有效診療。

1 主要基因檢測技術及特點

在美國國立衛生院2015年發布的精準醫學計劃中，將基因組技術推向了醫學和生物醫學研究的前沿[3]，推進了基因檢測技術的多樣性發展。對于未知致病基因的突變檢測，通常會選擇先用聚合酶鏈式反應(PCR)、單鏈構象多態分析技術、變性梯度凝膠電泳分析等篩選出突變基因，再采用基因測序對突變基因進行檢測，找出突變位點[4]。隨著快速平行測序技術的發展，基因測序具有速度快、成本低、通量高、自動化操作的特點[5], 一定程度上縮短了檢測時限，因此在臨床上廣泛應用。基因測序包括第一代測序、下一代測序(NGS)。第一代測序中，Sanger測序可對基因組的已知區域進行測序，并在2～3 d內讀取超過1 000個堿基對的序列，并檢測所有的突變、插入和缺失，已成為臨床和實驗室研究的核心力量; 焦磷酸測序需要特殊的測光強度儀器，一次運行也僅能識別15～95個堿基，與Sanger相比較并無優勢[6]。NGS分為第二代測序和第三代測序。第二代測序技術也被稱作高通量測序技術，包括可逆鏈終止測序、離子激流半導體測序等[7-8], 該技術具有高通量、高準確性、高靈敏度等突出優勢，但是也存在工作量大、費用高、讀長較短等缺點，對一些大的結構變異無法識別，而且測序前的克隆擴增步驟還可能造成錯誤引入，所以目前多用于實驗室。新興的第三代測序技術包括合成測序、離子半導體測序、納米球測序等，其可對DNA或RNA分子進行長時間的測序，并能可靠地解析重復序列和大型基因組重排，也能直接測序解析基因組區域，因此成為目前最常用的基因測序技術，但是仍存在堿基對讀取的準確性較低、儀器和生物信息學所需的成本較高等問題，而解決這些問題則可能是未來實驗室研究的重大突破點[6, 9]。

2 遺傳性易栓癥的相關致病基因及功能特征

自1965年遺傳性易栓癥患者的首個致病基因—抗凝血酶基因缺陷被報道后，臨床醫生在診療過程中逐漸重視血栓形成的遺傳因素，完善基因傾向性檢測以明確病因，尤其隨著NGS技術的普及，發現了G20210A突變、Leiden突變、Cambridge突變、Liverpool突變、ATBp3突變、C677T突變等數百種相關致病基因。

2.1 F2基因

F2基因編碼的凝血酶原可被活化為凝血酶，促進纖維蛋白原轉變成纖維蛋白而形成血栓，其主要抑制物為抗凝血酶(AT)。F2基因596位的突變可降低凝血酶與血栓調節蛋白的結合能力，影響蛋白C途徑的抗凝作用，促進血栓形成[2]。目前已報道的F2基因突變有PTM突變(G20210A)、Yukuhashi(Arg596Leu)、Amrita(Arg596Gln)、Padua2(Arg596Trp)。PTM通過提高凝血酶原轉譯過程中mRNA的3′未翻譯區域的末端核苷酸的處理效率和準確度，導致凝血酶原血漿濃度升高，形成高凝的血栓前狀態，這種突變在高加索人群中高發，在中國人群中的發生率較低。Amrita是中國人群的熱點突變型，其突變體的抗凝血酶抑制功能受損，致使凝血酶功能平衡向促凝途徑轉移[10]。在荷蘭人群中發現的C1621T錯義突變，其是通過增加凝血酶電位和降低肝素抗凝功能而形成靜脈血栓栓塞癥(VTE)。有復發VTE病史的患者或家庭，不可忽視這些新突變或其他新的潛在遺傳機制。

2.2 F5基因

F5基因編碼的凝血因子V(FV)經水解活化為FVa, 作為FXa的輔因子加速凝血酶的形成，也可經活化蛋白C(APC)裂解后，協同蛋白S(PS)發揮抗凝活性。然而,F5基因易突變而導致FVa產生異常的蛋白C(PC)切割位點，抵抗APC的裂解，導致抗凝功能受損。常見的錯義突變有Leiden(Arg506Glu)、Hong Kong突變(Arg306Gly)、Cambridge突變(Arg306Thr)、Liverpool突變(Ile359Thr)、HR2單倍型(A4070G)、Bonn突變(Ala512Val)。Leiden突變造成FVa抵抗APC作用，凝血酶濃度增加，導致血栓前狀態。Liverpool突變似乎會導致碳水化合物鏈增加，干擾位于相對遠離殘基Asn357的結合位點，顯著降低Arg306的裂解率，使FVa抗凝活性降低，也不能裂解FVIIIa, 促成血液高凝[11]。

2.3 SERPINC1基因

SERPINC1基因對突變很敏感，甚至微小錯義突變都可能導致其編碼的AT產生缺陷[12]，使血栓形成的風險增加9.8倍[13]。由于目前檢測AT缺乏癥的診斷方法的局限性，不能準確檢測到突變的反應位點(IIRS)、肝素結合位點(IIHBS), AT缺乏癥檢出率較低(<1%)[14]。但是, AT-ⅡHBS(Pro73Leu、Asn77His、Arg79Cys、Arg79His、Leu131Phe、Gln150Pro)與動脈血栓形成相關，尤其是Pro73Leu和Arg79His突變，減弱了肝素誘導的抗凝血酶活性。曾偉等[13]發現的新復合突變熱點，即G883A(Val295Met)、G881T(Arg294Leu)和C880T(Arg294Cys), 可能通過減弱天然抗凝血酶與靶蛋白酶的相互作用，使中國人群VTE的風險增加近20倍。Cambridge Ⅱ突變(Arg416Ser)更是被證明與心肌梗死有關[15]。

2.4 PROC基因

PROC基因編碼的PC是一種具有抗凝特性的糖蛋白。PROC基因突變或多態性易引起PC缺乏，抗凝功能受損，產生VTE。遺傳性PC缺乏常見的突變有的Arg189Trp[16]、Asp297His(變異率51%)、K193del、Arg147Trp和Lys150del等，其中部分致病性不明。已知的Arg189Trp突變不會顯著影響PC的分泌和降解，但會導致蛋白結構改變，阻礙PC與細胞表面磷脂、PS以及部分凝血因子的作用，是中國VTE的普遍危險因素，將該變異納入常規易栓檢測可改善靜脈血栓形成的診斷和預防[17]。Arg147Trp和Lys150del編碼的PC都有正常的酰胺水解和蛋白水解活性，但是前者與內皮蛋白C受體結合的親和力降低約3倍，導致抗凝作用減弱; 后者在強效輔因子存在情況下仍會使抗凝活性受損2～3倍[18]。目前關于PROC基因突變的報道較少，未來可以擴大樣本數據，以客觀準確地評估其突變在中國人群中減弱抗凝的作用。

2.5 PROS1基因

PROS1基因編碼的PS可顯著增強APC對凝血限速因子的滅活作用，抑制凝血酶的形成。單一PROS1基因突變患者的靜脈血栓發病率較低，僅當合并其他繼發性危險因素(例如妊娠、口服避孕藥、手術等)時, VTE的發病率才會明顯升高。中國人群中常見的突變類型有無義突變、錯義突變(例如Arg355Cys、Leu607Ser)以及剪切位點突變，剪接位點突變可引起mRNA的異常剪接，改變翻譯閱讀框并且提前終止翻譯過程，最終產生不穩定的PS突變蛋白[19]。錯義突變表達的細胞經裂解后的產物和PS水平降低，導致PS折疊異常，不能將活性凝血酶限制在損傷部位，導致血栓彌漫性形成。

2.6 MTHFR基因

MTHFR基因編碼亞甲基四氫葉酸還原酶，在蛋氨酸和葉酸代謝以及蛋白質、DNA和RNA合成中具有關鍵作用[20], 可將同型半胱氨酸甲基化為蛋氨酸。目前報道了34種罕見但有害的突變[21], 通常與其他缺陷基因共同降低MTHFR活性，導致同型半胱氨酸水平升高，增加動脈閉塞性疾病和靜脈血栓形成危險度[22]。較為常見的有MTHFR C677T突變 (Ala222Val)和A1298C(Glu429Ala), 兩者可降低體外MTHFR酶活性，兩種突變獨立存在時，對血栓形成產生相反作用; 共同存在時，對血栓形成產生協同作用[23]。

2.7 JKA2基因

JAK2編碼表達的Janus激酶(JAK)是一類位于胞漿內的非受體型蛋白酪氨酸激酶。JAK2突變導致機體血細胞增多、血液黏度增加、血液凝固和血管壁內皮改變，影響細胞黏附。已知的JAK2V617F是一種獲得性突變，是門靜脈和腸系膜靜脈血栓、腦室出血的高危因素，通常與慢性骨髓增殖性腫瘤相關，包括真性紅細胞增多癥、原發性血小板增多癥和原發性骨髓纖維化。目前越來越多的證據[24]支持JAK2V617F突變可以作為血栓形成的新危險因素，盡管尚未提供前瞻性臨床數據驗證，但是對于全血細胞計數升高的病例，應進行JAK2V617F突變篩查以防止血栓形成[25]。

2.8 TFPI基因

TFPI基因編碼的組織因子途徑抑制物(TFPI)可調控外源性凝血途徑、抑制游離凝血酶，限制損傷部位的凝血反應。以往對于TFPI更關注研究出血性疾病的靶向抗TFPI(例如康珠單抗)，但是現在發現TFPI水平降低會增加靜脈血栓形成和動脈粥樣硬化性疾病的風險[26]。已知TFPI突變(Cys399Thr、Thr287Cys、Thr33Cys和Val264Met等)和靜脈血栓形成患者的TFPI水平降低有關[27], 但是作用機制還需要在更大的患者群體中進行更多的研究來驗證。

3 遺傳性易栓癥基因診斷流程

關注和篩查遺傳性易栓癥，不是純粹的實驗室檢查[28], 也不能盲目檢測靜脈血栓栓塞患者的血栓形成傾向[29], 僅在具有特定適應證的患者中篩查[28]。依據臨床易栓癥評估和實驗室檢查確定篩查方向和順序，臨床醫生層層評估推進，判斷是否需要基因檢測。對于排除獲得性高危因素(>60歲、骨髓增殖性腫瘤、PNH、庫欣綜合征等)的血栓首發患者，可先行基因擴增，使用第二代全外顯子測序對先證者及其父母進行常見突變位點的篩查，一旦發現陽性結果，再對家系中全部直系親屬進行驗證[1], 同時應告知親屬基因突變只是易患靜脈血栓栓塞性疾病的一個危險因素。進行定期風險評估并實施必要的臨床干預，但并非所有具有相同突變的患者都會發生血栓栓塞[28, 30]。對于檢測結果呈陰性的易栓癥患者，需要進一步行全外顯子或全基因組測序篩查，并且通過家系共分離等技術尋找家系中可能存在的新致病基因[31]。

4 總結及展望

中國人群的遺傳性易栓癥診斷主要針對抗凝蛋白的檢測，其表型檢測結果易受到干擾[1, 32], 而隨著測序技術的發展，準確性高的基因檢測正逐漸成為主要的診斷方式。基因檢測能早期診斷和明確病因，幫助臨床醫生開展個性化診療，為高危人群提供適當的干預措施。基因突變有異質性，國外的易栓癥篩查研究并不適用于指導評估國內易栓癥患者的血栓性疾病風險，還需進一步將區域基因分布特點結合臨床表型，完善國內的基因譜，制訂實用的基因檢測方案; 同時，建立相匹配的高通量測序技術，使許多基因在個體患者身上能夠進行研究，而這些都可能是未來易栓癥診治的新方向。