Cathepsin D在宮頸鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義*

歐陽晨捷 周東華 劉小燕 陳 瑩

廣東省佛山市婦幼保健院病理科 528000

在各國女性所罹患的惡性腫瘤中，目前宮頸癌是嚴重威脅女性生命健康的第二大“殺手”，據報道，在發達國家中宮頸癌5年存活率約為66%，而在發展中國家，甚至低于50%。而在我國女性所患宮頸癌中，每年新增人數約為9.89萬，占世界宮頸癌總人數的17.4%，每年死亡的人數達到3.05萬，有發病率不斷上升及發病年齡日趨年輕化的跡象[1]。宮頸鱗狀細胞癌是宮頸癌中最常見的組織學類型。目前宮頸癌的病因尚未完全明確，與宮頸癌發病相關的因素錯綜復雜，因此，提高宮頸癌的診治水平是當下十分緊迫的任務。

近年來，研究發現組織蛋白酶(Cathepsins)作為人體中重要的信號分子，占體內酶的2%左右，有序地調節著人體的生命過程，并且受到嚴格的調控，一旦任何的失調，都會導致腫瘤的發生。根據氨基酸活化部位的不同，Cathepsins家族有11個成員，分布于各種哺乳動物組織的細胞溶酶體內，是一組具有強效的溶酶體水解酶，是一類腫瘤侵襲、轉移相關的酶[2]。Cathepsin D是Cathepsins家族中的一員，其基因定位于染色體11p15.5，是一種天冬氨酸溶酶體蛋白水解酶，在不同惡性腫瘤組織中呈差異性的表達，在胃癌、結直腸癌等多種腫瘤的發生與發展中起到了促進的作用[3-4]；但是，Cathepsin D在宮頸鱗癌中的表達情況鮮有相關報道。故本研究同時檢測宮頸鱗狀細胞癌和正常子宮頸組織中Cathepsin D蛋白的表達情況，分析Cathepsin D的表達水平與宮頸鱗狀細胞癌中患者各病理特征的關系，對Cathepsin D在宮頸鱗癌發生發展過程中的作用做一初步探討，為提高宮頸癌的診治水平提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源 本課題組收集了佛山市婦幼保健院病理科2018年1月—2020年8月由病理確診的40例子宮頸鱗狀細胞癌手術切除的患者組織標本及臨床資料，同時選取同期正常的宮頸上皮組織標本28例作為對照組。納入標準：(1)有完整的臨床資料；(2)子宮頸鱗狀細胞癌病例均為原發，取材前都未做過放、化療等任何特殊治療，也無特殊疾病史；(3)正常的宮頸上皮組織標本來源于因子宮肌瘤和(或)子宮腺肌癥行子宮全切術的住院患者，術前常規行宮頸液基細胞學檢查，未見異常，并通過病理證實為慢性宮頸炎的組織。排除標準：(1)合并有其他部位的惡性腫瘤；(2)正在參與其他課題組研究的病例。本實驗中子宮頸鱗狀細胞癌患者共40例，患者年齡28～65歲，中位年齡45歲，其中<45歲13例，≥45歲27例；腫瘤直徑≤4cm 33例，>4cm 7例；組織學分級根據2014版世界衛生組織(WHO)標準，其中高分化13例，中～低分化27例；臨床分期按照國際婦產科聯盟(FIGO)2009年修訂的標準，其中Ⅰ+Ⅱ期30例，Ⅲ+Ⅳ期10例；浸潤深度<1/2肌層34例，≥1/2肌層6例；術中均進行淋巴結清掃，并經術后證實有淋巴結轉移22例，無淋巴結轉移18例。兩位病理醫師對所有實驗對象的病理診斷一致。本研究通過了我院倫理委員會的審批。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆抗體Cathepsin D(D-7):sc-377299購自美國Santa Cruz Biotechnology,Inc，免疫組織化學Power Vision二步法試劑盒(PV-9000)購自北京中杉金橋生物技術有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色方法 所有組織標本切開固定于10%的福爾馬林里，用石蠟包埋好的蠟塊連續切片2張，分別用于HE染色和免疫組織化學染色，每張切片的厚度為4μm，使用環保透明劑脫蠟，梯度乙醇脫水。將處理好的組織切片用0.01mol/L的枸櫞酸緩沖液高壓修復10min，冷卻到室溫后，PBS沖洗3次，每次3min；3%H2O2室溫孵育10min，PBS沖洗3次，每次5min；滴加稀釋濃度為1∶50的Cathepsin D一抗后，按Power Vision二步法免疫組織化學試劑盒(PV-9000)的說明書操作進行。DAB顯色劑顯色，蘇木素復染，返藍，脫水，透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。以Cathepsin D抗體試劑盒說明的涎腺組織作為陽性對照標本，同時采用PBS液取代一抗作為陰性對照標本。

1.4 結果判定 Cathepsin D蛋白陽性表達主要為細胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒，但要考慮到著色的強度及陽性細胞所占比例。本實驗建立了一個分值累加的系統：(1)按著色強度打分：無著色0分，淡黃色顆粒1分，棕黃色顆粒2分，棕褐色顆粒3分；(2)在目鏡視場數為22的200倍顯微鏡下，隨機看5個視野，取平均值，按陽性細胞所占比例打分：<1%計為0分，1%～10%計為1分，>10%且≤50%計為2分，>50%且≤80%計為3分，>80%計為4分。將(1)(2)兩項分值相加為免疫組化最終評分，陰性：0～1分，陽性：2～7分。全部實驗對象的免疫組織化學染色切片由兩位病理醫師一致性雙盲觀察診斷完成。

1.5 統計學方法 所得數據輸入SPSS25.0軟件并進行統計學的分析。各組間率的差異采用χ2檢驗。兩組變量間的相關分析采用Spearman等級相關分析。檢驗采用雙側檢驗，P<0.05時為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Cathepsin D的免疫組織化學結果 應用Power Vision二步法檢測結果顯示，Cathepsin D蛋白主要表達于細胞質，陽性顆粒為棕黃色或棕褐色。本組40例宮頸鱗狀細胞癌組織中38例為陽性，2例為陰性，陽性表達率為95.0%；28例正常子宮頸組織中4例為陽性，24例為陰性，陽性表達率為14.3%。兩組間Cathepsin D蛋白的表達不完全相同，且Cathepsin D蛋白的表達在宮頸鱗癌組織中的陽性率顯著高于正常子宮頸組織(χ2=45.437，P<0.01)。

2.2 Cathepsin D在宮頸鱗癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系 如表1所示，經過統計學分析，Cathepsin D蛋白的表達與宮頸鱗癌組織的分化程度、臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移密切相關，差異有顯著的統計學意義(P<0.05)，而與患者的年齡、腫瘤直徑的大小無關，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 Cathepsin D與宮頸癌組織中各臨床病理參數之間的關系

3 討論

宮頸鱗癌的發生發展是一個循序漸進的過程，從組織非典型增生到原位癌再到浸潤癌，病因尚不完全清楚。目前對宮頸鱗癌的早期診斷及預測轉移也無統一的腫瘤標志物。但是，宮頸癌的治療效果與是否轉移密切相關。隨著近年來腫瘤研究的不斷深入和發展，有關Cathepsin D的分子生物學研究也得到了極大的發展。新近研究表明，Cathepsin D不僅在生理情況下起著至關重要的作用，而且與腫瘤的發生發展也關系密切。

Cathepsin D主要分布在細胞內溶酶體、囊泡、吞噬體及次級內涵體內，最開始是以天冬氨酸蛋白酶原(相對分子量為52000)的形式合成于粗面內質網，接著被快速轉移到核內體，具有活性，形成單鏈中間產物(相對分子量為48000)，并且在酸性環境中完全活化，形成有催化活性的重鏈(相對分子量為34000)和輕鏈(相對分子量為14000)蛋白，在生理情況下，Cathepsin D促進正常細胞分裂、增殖和移動[5]。

Cathepsin D的異常表達可導致細胞分裂、增殖和移動的異常，最終促使腫瘤的發生與發展[6]。在腫瘤的酸性微環境中，Cathepsin D的高表達可作為一種絲裂原會引起有絲分裂時，有絲分裂原底物的調控失常引起細胞分化的缺乏，并且刺激細胞不斷迅速分裂、生長，繼續分裂、生長來達到細胞生長的失常引起克隆性無限增殖[7]。本研究檢測了Cathepsin D在宮頸鱗狀細胞癌組織和正常宮頸組織的表達，免疫組織化學法顯示Cathepsin D蛋白在癌組織和正常宮頸組織中均有表達，但是Cathepsin D在癌組織中的陽性率顯著高于正常宮頸組織，符合宮頸鱗癌的進展過程，可提示Cathepsin D的表達上調促進了宮頸鱗癌的發生與發展。

Cathepsin D作為Cathepsins家族中的一員，是一種強效的溶酶體水解酶，在多種腫瘤的侵襲轉移中發揮著至關重要的作用。研究表明，Cathepsin D的表達上調通過水解作用會促進基底膜和細胞外基質的降解[8]，導致細胞骨架的崩塌，引起細胞黏附性的下降，且對血管和淋巴管的基底膜有溶解作用，并在周圍形成溶解區域，成為腫瘤細胞的移動通道，促使腫瘤細胞的侵襲性生長。除此之外，Cathepsin D的過度表達還可激活溶酶體靶通道，讓Cathepsin D蛋白酶原及其他溶酶體酶不斷分泌和釋放[9]，進一步促進了周圍局部溶解區域的形成，為腫瘤細胞的侵襲轉移提供了非常便利的“綠色”通道，進而激發了腫瘤細胞侵襲轉移的潛能。本研究通過分析發現，Cathepsin D蛋白的表達與宮頸鱗癌組織的分化程度、臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移密切相關，差異有顯著的統計學意義(P<0.05)，支持宮頸鱗癌的進展過程，可提示Cathepsin D的表達上調促進了宮頸鱗癌的侵襲轉移。相關報道指出[10]，血清中Cathepsin D水平在宮頸鱗癌組是顯著高于不典型增生組和慢性宮頸炎組，與宮頸鱗癌臨床分期、分化程度、間質浸潤深度、盆腔淋巴結轉移有不同程度相關，對宮頸鱗癌的診斷與轉移預測具有非常重要的價值，與本課題組在組織學上對Cathepsin D蛋白表達水平的檢測相一致，并且在腫瘤的分化程度、臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移上都是密切相關的。

綜上所述，Cathepsin D在子宮頸鱗狀細胞癌發生發展過程中表達逐漸升高，說明Cathepsin D在宮頸癌的發生發展中起到了一定的促進作用，可能參與了宮頸鱗癌的侵襲轉移過程，檢測其表達情況有可能為評估宮頸鱗狀細胞癌的轉移潛能和預后提供參考依據。Cathepsin D促癌作用的機制可能與促進有絲分裂、基底膜和細胞外基質降解和激活溶酶體靶通道等途徑有關，但這一推測需要后續的實驗研究進一步驗證，其具體機制還有待進一步深入探討。