環狀RNA在卵巢癌中的研究進展

王冠 張惠晶 王爽 段麗 邢焱玲 王莉莉 李佩玲

作者單位：1 黑龍江省醫院婦產科，黑龍江 哈爾濱 150000；2 哈爾濱醫科大學附屬第二醫院婦產科，黑龍江 哈爾濱 150000

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是婦科惡性腫瘤中病死率最高的疾病，每年有超過20 萬例的新增診斷病例。據報道，中國卵巢癌患者的5 年生存率在2005—2014 年變化甚微，低至30%，60%的患者在最初診斷時已處于卵巢癌Ⅲ期至卵巢癌Ⅳ期，復發和轉移率高，難以在疾病早期進行診斷[1]。腫瘤細胞減滅術和輔以鉑類為主的聯合化療，是目前OC 標準化治療的主要方法。缺少有效的預防措施、早期治療的困難和化療耐藥而引起的復發都是造成低水平總生存期（overall survival，OS）的主要因素。OC 的發生與組織中基因的表達改變有關，這些基因調控著腫瘤細胞的生長和轉移，是腫瘤惡性進展的關鍵因子。上述原因，使得尋找用于OC 診斷與預后預測的潛在生物標記，以及發現新的醫學治療靶點的任務越來越緊迫。文章主要就環狀RNA（circular RNA，circRNA）的分子特征、在惡性腫瘤中發揮的作用、其作為OC 生物標志物的可行性，以及其作為內源性RNA 吸附微小RNA（microRNA，miRNA），上調miRNA 靶基因的表達，間接參與OC 的發生、發展過程作一綜述。

1 circRNA 分子概述

人類基因組計劃顯示，約3 萬條人類基因組能夠完成蛋白質的編碼。此比例在人類基因組序列的總數中不超過3%。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）一直被認為是不能編碼蛋白質的“垃圾區域”。事實上，非編碼RNA 與人類疾病關系密切，在正常生理水平和病理狀態下進行非編碼RNA 機制的研究。在正常生理水平和病理狀態下進行ncRNA 機制的研究，能夠為廣大醫務工作者在疾病早期診斷和治療中，提供新的思路和理論依據。

研究結果表明，ncRNA 中的circRNA 并不具有直接編碼蛋白質的功能，在人身體的不同組織中廣泛表達。其在惡性腫瘤組織與細胞中異常表現，同惡性腫瘤的產生和進展之間也存在著聯系，已被證實在臨床中具有潛在的應用前景?？蒲腥藛T們希望通過對circRNA 作用機制的深入研究，能夠進一步揭開惡性腫瘤發生發展的潛在機制，進而給惡性腫瘤的預防與治療帶來全新的思考。早在20 世紀70 年代，circRNA 就已第一次在電子顯微鏡下觀察病毒時被發現了。circRNA 是非編碼RNA 族中最晚發現的RNA，主要來自前體信使RNA（precursor messenger RNA，pre-mRNA），是廣泛分布于所有真核生物中的新型內源性RNA。和傳統的線性RNA 結構不同，它一般是在進行蛋白質編碼外顯子時，因經過相反方向的剪接，形成了連結于3’和5’末端上的共價鍵結構。如與Alu 元件或RNA的結合蛋白（RNA binding proteins，RBPs），比如震動蛋白（quaking protein，QKI Protein），即可產生circRNA[2]。

2 circRNA 的生物學特性

按照circRNA 的小分子、亞細胞定位構造及其他的環化共價鍵等化學結構的特征，circRNA 主要包括以下4 個類型：（1）外顯子circRNA（exonic circular RNAs，ecircRNA），是通過外顯子的反向拼接而成的。通過其上的內含子連接而形成的環化，或通過套索結構而進行環化以及外顯子的跳躍，如具有互補序列，就可以直接進行堿基配對成環，并進行剪接生成circRNA，最終形成外顯子來源circRNA。外顯子來源的circRNA 主要分布在細胞胞漿中，并具備與miRNA 結合的化學元件，已被證實在被轉錄后，調控基因表達，并在惡性腫瘤組織中發揮重要功能。（2）內含子來源的circRNA（intronic RNA，ciRNA），可分為Ⅰ類和Ⅱ類。線性內含子通過與其末端的鳥苷酸2'羥基健融合，從而接近了3’末端的磷酸二酯鍵，最終取而代之，環化成RNA。（3）外顯子-內含子circRNA（exon-intron circular RNA，EIciRNA），其形成機制類似于ecircRNA。不同之處在于，RBP 能夠對部分EIciRNA 進行調控。RBP 還能夠通過結合上下游附近的ciRNA，進而使內含子間距大大縮短，以實現對EIciRNA 的調節。可能參與了基因的調控、轉錄以及選擇性剪切。（4）通讀環狀RNA （read- through circRNA，rtcircRNA）。circRNA 有如下生物學特性：（1）表達的豐度差別很大：在人組織、血液及外泌體中均能檢測到circRNA 的表達。有研究團隊曾報道，circRNA 在人體的成纖維細胞中，已出現過25 000 種之多，在人腦組織中，超過65 731 種circRNA通過高通量檢測被發現[3]。某些circRNA 的表達量是一般線性RNA 的10～20 倍以上，circRNA 可能是比mRNA 更加主要的轉錄本。（2）結構穩定性：由于所有circRNA 都具有共價的閉合環構造，而無5’端帽子結構和3’端多聚體A 尾構造，使之可以有效抵抗核糖核酸酶的分解，而不宜被核酸外切酶所剪切。而與之相對應的線性RNA 的半衰期一般少于20 h。（3）保守特征：circRNA 在不同類型的生物種類間，也表現出了高度進化的保守特性。有學者在對人與老鼠circRNA 的比較研究表明，circRNA 的表達僅占直系同源基因的4%。表明circRNA可能在轉錄水平產生主要影響[4]。因此它可被認為是疾病診斷的理想生物標記物之一，需要進一步的科學研究來證實。（4）特異性：比如在乳腺癌細胞系MCF-7 中，發現circ-DOCK1 呈現相對高表達水平，但是它在肺癌細胞系A549 中，卻未發現異常表達[5]。

3 circRNA 的功能

近年來，有關于circRNA 作用功能的研究成果較多。circRNA 能夠調控其他類型RNA，通過基因互作網絡的建立，來調控靶基因的表達。多數研究結果證明它主要在以下幾個方面發揮了生物學功能：（1）作為競爭內源性RNA 結合miRNA，以調控靶基因的表達[6]。由于circRNA 分子富含與miRNA 相結合的堿基互補位點，因此通過與相應的miRNA 結合，能夠消除miRNA 對其相應的靶基因mRNA 的調控，此過程使靶基因mRNA 的表達水平提高，進而實現了在轉錄水平上對靶基因的控制。另外，根據既往報道，大部分的circRNA 分布于細胞胞漿中。這為circRNA 能夠吸附于miRNA 家族，并作為miRNA 的海綿，提供了理論基礎。（2）circRNA 可以調節premRNA 的剪接。ecircRNA 可以調節pre-mRNA 選擇性剪接或能夠經與其對應的線性RNA 相互競爭，而抑制其親本基因的表達，兩者之間呈現出負性相關。（3）circRNA 能夠對親本基因進行調控。近期的科學研究也證實，circRNA 能在RNA 聚合酶Ⅱ的作用下調節親本基因[7]。可以在與RNA 聚合酶Ⅱ復合體進行連接后，加速基因轉錄，由此達到對自身編碼基因轉錄活性進行調節的目的。（4）circRNA 與蛋白質的相互作用：研究表明，circRNA 能夠與RBP 形成RNA-蛋白復合物，從而調控RBP，作用于靶基因發揮的生物效能[8]。或者circRNA 可以通過與部分堿基互補匹配的方法，間接完成了對靶基因的控制。另外，circRNA 也可以通過與其相關的蛋白質形成關系，對蛋白質的功能形成影響，但此過程需要通過RNA 介導。（5）翻譯功能：大多數學者認為，circRNA 不具備翻譯功能。但是，它可以通過與mRNA 競爭性地結合RBP 堿基互補位點來調節翻譯的過程。另外，部分環狀RNA，可以通過內部核糖體進入位點結合到核糖體上，插入并合成circRNA 之后，就可以翻譯蛋白。

4 circRNA 在腫瘤發生發展中的作用

二十年來，高通量測序、RNA 提取、PCR 及蛋白印跡等技術手段，推動了分子生物學的快速進展。研究者們對關于circRNA 在人類腫瘤中的產生和進展，及對其功能的認識，也正是通過對被鑒定識別的circRNA 數量的提高和對其功能方面的深入研究，才能完成。有許多研究人員通過上述分子生物技術都檢測到了circRNA 的異常表達。如在乳腺癌、肺癌、膠質瘤及胰腺癌等的惡性組織中的circRNA 和相對應的正常組織和/或癌旁組織，均具有不同表現。有關研究的論文報道量也在逐漸遞增，其功能機理也越來越清晰。circRNA 的相對穩定性強，高特異率，含量豐富，在癌癥組織與正常組織中具有顯著的表達差異等特點，是未來作為惡性腫瘤早期診斷的較為理想的生物標記物。目前的研究成果已經證明，circ-0000190 可能是一個全新的無創胃癌檢測生物標記物，其敏感度和特異性程度都高于臨床上用于常規腫瘤檢測的CEA、CA-199 等[9]。circ-0013958 可作為無創生物標記物，對肺腺癌進行早期檢測和篩查。有研究人員證明了circRNA 與miRNA 之間的主要作用方式是由于circRNA 中具有許多與miRNA 家族堿基序列互補匹配的結合位點，可成為miRNA 的分子內“海綿”[10]。當miRNA 分子像“海綿”那樣被circRNA 所吸收后，miRNA 失去對靶基因作用，從而使得miRNA 的靶基因表達水平顯著提高，間接地參與了許多惡性腫瘤的發生、進展等過程。研究表明circRNA 可能是與miRNA 競爭的ceRNAs，以調控基因表達和變異[11]。例如，circABCC2 通過浸潤miR-665 促進肝癌的進展[12]。circHECTD1 通過靶向miR-1256 和激活catenin/MYC 通路促進胃癌發展[13]。在惡性腫瘤產生與發展的過程中，circRNA 主要是通過影響惡性腫瘤細胞的生長發育、上皮間充質轉化等步驟控制惡性腫瘤細胞的發育生物學活動[14]。其中，上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一種轉化過程，是腫瘤形成中的關鍵步驟，可將上皮來源的細胞驅動為惡性腫瘤。circRNA 可以通過影響MAPK/ERK 通道、影響PI3K/AKT 通道，以及影響周期的調控點等來控制腫瘤細胞生長。如在PI3K/AKT 途徑中，配體通過和接受器酪氨酸激酶的結合，活化了PI3K，從而使得AKT 被磷酸化，以促使細胞的正常生長。在這一過程中，CDR1as 和circNT5E通過促進PI3K 的表達，來控制肝癌細胞的正常生長進程[15]。ciRS-7 消除miR-135a-5p 對胃癌的抑瘤作用，也是通過該信號通路[16]。根據Shuai 等[17]的報告研究成果，circ-0000285 很可能會是鼻咽癌患者預后的一個獨立因素，提示了circ-0000285或許是鼻咽癌的一個新的生物標記物，并和鼻咽癌對放療的效果是否敏感有重要關系。類似的，也有研究報告指出，circ-HIPK3 分泌量，同時還能作為鼻咽癌患者預后的1 個指標[18]。

5 circRNA 在OC 中研究進展

近年來，有關circRNA 在婦科惡性腫瘤中的研究也越來越多，現將circRNA 在OC 中的相關研究匯總如下。

目前在卵巢癌中發現了較多異常表達的circRNAs。Ahmed等[19]運用高通量測序的方法，對3 例晚期OC 原發病灶組織、腹膜轉移病灶組織以及淋巴結轉移病灶組織進行了全面的circRNA 測定。結果顯示，在OC 中，可檢測和鑒定出數萬種circRNA 的表達異常。在OC 原發癌灶小組中，circRNA的相對表達水平也遠高于其所對應的線性mRNA。相關文章報道，對于那些和腫瘤相關的生物信號通道，例如TGF-β、NF-κB 等。因為線性mRNA 及circRNA 有共同表達的趨勢，產生了完全相悖的表現形式。而circRNA 的高穩定表達，為腫瘤診斷、治療和預后，提出了高效的、完整的候選分子。為了探討OC 中circRNA 的表達譜，Ning 等[20]共收集54 例卵巢癌標本和54 例正常卵巢組織。與正常婦女卵巢組相比，共4 000 多個circRNA 在EOC 組中的表達升高，差異明顯。另外，有兩千多個circRNA 在EOC 組中的表達上升，另有1 800多個circRNA 表達下降。Guan 等[21]證實，circ-ANKRD12 在SKOV3 中的表達高于卵巢正常上皮細胞。在SKOV3 和A2780細胞中，ANKRD12 沉默后，細胞的侵襲和遷移過程被抑制。Zhao 等[22]研究成果表明，circRNA-MYLK 的低表達與卵巢癌患者的預后不良有關。此外，circ-ITCH 與EOC 的TNM 分級、卵巢癌病灶大小以及FIGO 的分期呈負性相關，而與OS 呈正性相關，起到抑癌效果[23]。研究表明，circ-HIPK3 在卵巢癌組織中，表達異常升高，與卵巢癌的預后不良相關[24]。有研究發現，circ-0051240 在卵巢癌組織中，表達異常升高，體內移植腫瘤的發育也受到很大程度的抑制[25]。Chen 等[26]的研究結果顯示，在沉默circ-NOLC1 后，卵巢癌細胞的侵襲能力受到明顯的遏制。Gan 等[27]的研究則表明，circRNA-MYLK 在OC 組織的表達明顯高于癌旁組織。與circRNA-MYLK 低表達患者相比，circRNA-MYLK 高表達患者的病理分期更高，總生存率更低。沉默circRNA-MYLK，OC 細胞增殖能力明顯減弱。這樣的研究方式還有很多，但由于腫瘤的產生與發展都是多個因素影響和多環節調控的復雜過程，因此circRNA 具體的調節機理還需逐步明確。

上述研究表明，circRNA 在OC 組織與細胞系中存在表達差異。由于它具有共價閉合結構且不易被外切酶所消化，表達水平穩定。circRNA 可能在OC 的進展中產生重要影響，并發揮了癌基因和抑制癌基因的重要功能，circRNA 還能夠作為分子標記輔助檢測與治療OC，為研究OC 發病過程和惡性發展提出了新的潛在靶點，對治療包括癌癥在內的許多慢性病具有著重大的意義。circRNA 作為miRNA 的ceRNA，在OC 的發生及惡性發展過程中扮演著關鍵調節作用。在癌癥組織中，特異性表達的circRNA 可作為小分子誘餌吸附于miRNA 網絡中。而miRNA可通過對靶基因表達的抑制而調整circRNA 的表達水平。而對circRNA 來說，其最主要的調節機制便是成為miRNA 的海綿，這樣才能上調miRNA 家族以及下游靶基因的功能。而circRNA、miRNA 及其被控制的靶基因組，在OC 的調節中可能發生著相互協調、相互制約的關系。研究可以說明三者的相互關聯，在癌癥發生發展的相關分子機制中意義非凡，也豐富了癌癥篩查、治療的思路與方向。探索在OC 發生進展過程中的重要基因和調控通路，能提高OC 的早期治療效果和改變治療現狀，進而改善OC 患者的生存率。研究circRNA 對OC 惡性生物活動的控制效果并闡述其機理，以期為OC 的防治提出全新的思想。

OC 是女性生殖系統中最常見的惡性腫瘤之一，同時還是女性惡性腫瘤中死亡率最高疾病。早期診斷困難，且后期發展迅速。目前相關研究發現circRNA，如circRNA-UBAP2、circ-CELSR1、circ-TNPO 等均可能參與了OC 細胞增殖、侵襲、血管生成和淋巴管生成、自噬以及紫杉醇耐藥等多種生物學過程[28-30]。在正常生理水平和病理狀態下進行circRNA機制的研究，能夠為廣大醫務工作者在腫瘤早期診斷和治療中，提供新的思路和理論依據，為卵巢癌開發新的藥物靶點，開拓新的方向，以提高OC 的早期治療效果和改變治療現狀，進而改善OC 患者的生存率。但是，由于circRNA 數量眾多，其具體的細胞學功能及在癌癥發生和進展中詳細的分子機制尚未完全清楚，特別是circRNA-miRNA-mRNA 構成了復雜的調控網絡，有些下游靶基因的作用廣泛。有關circRNAs 與OC 之間發生發展機制的研究，仍有相當多的問題有待探討和發現，大部分circRNA 的功能仍未被研究。對circRNA 在各種疾病的進展中的生物學和分子機理還沒有被充分認識。但是，隨著現代生物工程技術和研究的進展，我們將識別更多的circRNA。circRNA 作為分子標記輔助檢測與治療OC，為研究OC 發病過程和惡性發展提出了新的潛在靶點，對治療包括癌癥在內的許多慢性病具有著重大的意義。