EZH2在小細胞肺癌惡性表型中的作用及其潛在調控機制

黃彩玲，甘思遠，劉 旺，蔡凱爾，宋 浩，舒 旭，何志巍,5，孫艷芹

2020年全球癌癥數據顯示，癌癥死亡人數約996萬，其中肺癌死亡人數約180萬，位居首位[1]。小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)是惡性度極高的肺癌類型，患者確診時常伴全身廣泛轉移[2]，雖然在SCLC初期對患者進行細胞毒治療能產生效果，但絕大多數患者會迅速復發并對進一步的化療產生耐藥，導致患者生存期顯著縮短、預后極差[3]。因此，探究SCLC的發生機制及化療耐藥問題極具臨床診療價值。Zeste同源物2增強子(enhancer of zeste homologue 2, EZH2)是多梳抑制復合物2(PRC2)的催化單元，其通過組蛋白H3賴氨酸27三甲基化沉默許多參與腫瘤抑制機制的基因[4]。前期研究發現長鏈非編碼RNA HOTTIP與SCLC患者不良預后相關，因此本文重點探討EZH2對SCLC細胞增殖、凋亡和化療耐藥性的影響，并初步闡述EZH2作為長鏈非編碼RNA HOTTIP的下游效應分子的調控通路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和材料胎牛血清(Gibco公司)；小分子抑制劑GSK-126(MCE公司)；EZH2單克隆抗體(Abcam公司)；H3K27me3單克隆抗體(美國Abcam公司)；GAPDH抗體(Santa Cruz公司)；山羊抗兔多克隆IgG(Santa Cruz公司)；CCK-8試劑盒(同仁公司)。人SCLC細胞株H146、H446、H446DDP、H69、H69AR及人支氣管上皮樣細胞16HBE(ATCC公司)。

1.2 細胞培養以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基分別培養16HBE、H146、H446、H446DDP(基于H446細胞構建的順鉑耐藥株)、H69、H69AR(多藥耐藥細胞株)等細胞，取對數生長期的細胞用于下一步實驗。

1.3 引物的設計及合成EZH2的特異性引物由Thermo Fisher Scientific公司設計并合成。以GAPDH作為內參。EZH2引物序列：上游5′-ACATCC TTTTCATGCAACACC-3′，下游5′-GCTCCCTCCAA ATGCTGGTA-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GGG CTGCTTTTAACTCTG-3′，下游5′-TGGCAGGTTTTT CTAGACGG-3′。

1.4 qRT-PCR(1)RNA提取(TRIzol法)，保證1.80≤D260/D280≤2.00，總RNA濃度≥500 ng/μL。(2)逆轉錄反應：根據逆轉錄試劑盒說明書配制反應體系，反應包括逆轉錄反應階段(37 ℃ 15 min)和逆轉錄酶的失活反應階段(85 ℃ 5 s)。(3)PCR反應：根據qRT-PCR試劑盒說明書配制反應液。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，合計40次循環，72 ℃ 10 min延伸。3次獨立實驗后得到的數據運用公式RQ=2-ΔΔCt進行分析。

1.5 Western blot法細胞總蛋白提取后利用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，采用PVDF膜進行轉膜，并于室溫下封閉，分別用EZH2和H3K27me3的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后用羊抗兔IgG于室溫條件下孵育1 h，再次TBST洗膜后用DAB進行顯色。

1.6 CCK-8實驗(1)CCK-8實驗檢測增殖：于96孔板中接種細胞懸液，待細胞貼壁生長；加入CCK-8溶液；適時檢測450 nm波長處細胞的OD值；連續幾日在固定時間進行測定，繪制細胞生長曲線。(2)CCK-8實驗檢測藥物敏感性：接種細胞于96孔板中，細胞轉染后培養24 h；分別加入阿霉素、順鉑及足葉乙甙三種藥物，繼續培養24 h；再加CCK-8溶液，4 h后檢測450 nm波長處細胞的OD值。以上操作步驟重復3次，求各組細胞存活率的平均值，并計算各組細胞對藥物的IC50值。

1.7 流式細胞術采用流式細胞術檢測細胞周期和凋亡情況，采用Annexin V/7ADD凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率；細胞周期檢測需經70%乙醇于4 ℃固定過夜，經PI染色后再進行測定。

1.8 免疫組化本組前期實驗進行HOTTIP研究時已構建了裸鼠成瘤模型[4]，本實驗采用免疫組化SP法檢測HOTTIP下調細胞所成瘤體組織中EZH2和H3K27me3的表達。

1.9 生物信息學分析利用GEO、EGA和TCGA數據庫分析不同組織學類型的肺癌患者組織中EZH2的表達水平與其生存期的關系、EZH2啟動子區甲基化水平、肺癌組織中TP53突變與EZH2表達水平的關系。

1.10 統計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，兩組間比較符合正態分布時采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EZH2在SCLC組織及細胞株中的表達及預后指導價值分析通過生物信息學技術(Kaplan-Meier Plotter在線工具)分析基因表達與生存期的相關性發現，EZH2在肺鱗狀細胞癌中的表達與患者生存期無明顯相關性(P>0.05，圖1A)；而EZH2在肺腺癌組織中的表達與患者生存期呈負相關(P<0.05)，具有較好的預后指導價值(圖1B)。本組收集10對SCLC組織和癌旁組織，對上述生物信息學發現進行驗證分析，結果顯示EZH2在SCLC組織中的表達顯著升高(圖1C)，與上述結果一致。

EZH2在細胞株中的表達：與人支氣管上皮細胞16HBE相比，EZH2在H146、H446、H446DDP、H69、H69AR等5株SCLC細胞株中的表達較高，而相對于其親本細胞株H69和H446細胞，EZH2在化療耐藥細胞株H446DDP和H69AR中的表達更高(圖1D)。體外實驗采用有效的shRNA干擾質粒(2196或2278)下調相關細胞中EZH2的表達(圖1E)。

2.2 EZH2對SCLC細胞增殖和耐藥的影響采用小分子抑制劑GSK-126和EZH2 shRNA干擾序列抑制或者沉默EZH2的表達后，CCK-8實驗檢測細胞的藥物敏感性，結果發現：與兩陰性對照組(H69AR和H69AR/NC)相比，H69AR/sh-EZH2組和H69AR/GSK-126組細胞對三種化療藥物(阿霉素、順鉑和足葉乙甙)的化療敏感性均明顯增強(P<0.001)，即耐藥性下降(表1，圖2A)。CCK-8實驗分析細胞增殖發現，自細胞貼壁生長48 h開始，與陰性對照組相比，EZH2下調可減弱H146和H446DDP細胞的增殖能力(P<0.01，圖2B)。

表1 EZH2表達下調對H69AR細胞的藥物敏感性影響

圖2 CCK-8實驗檢測細胞化療反應性及增殖能力：A.細胞藥物敏感性；B.細胞增殖能力

2.3 EZH2下調對SCLC細胞周期及凋亡率的影響流式細胞術分析H446DDP細胞周期發現，與陰性對照組相比，EZH2下調后兩株細胞G2期細胞比例減少(圖3)。流式細胞術分析細胞凋亡發現，與陰性對照組相比，EZH2下調后兩株細胞均出現了細胞凋亡率的增加：細胞早凋率(P<0.01)及晚凋率(P<0.05)均呈現增加趨勢(圖4)。

圖3 流式細胞術分析EZH2下調對細胞周期的影響：**P<0.01

圖4 流式細胞術分析EZH2下調對H446DDP細胞凋亡的影響:*P<0.05; **P<0.01

2.4 EZH2下調對細胞甲基轉移酶表達的影響生物信息學技術分析發現，524例肺鱗狀細胞癌和571例肺腺癌中分別有369例和233例發生TP53突變，且EZH2表達均較其他兩組高(圖5A、B)。同時對EZH2啟動子區甲基化水平進行分析發現，EZH2啟動子區甲基化水平在肺鱗狀細胞癌及肺腺癌組織中均較低(圖5C、D)。為明確EZH2的表達與細胞中甲基轉移酶的關系，使用梯度濃度的EZH2小分子抑制劑GSK-126處理細胞后發現，隨著GSK-126劑量的不斷升高，細胞中EZH2蛋白的表達梯度下降，而細胞中甲基轉移酶H3K27me3的表達量也同樣呈梯度下降(圖5E)。

為進一步觀察HOTTIP和EZH2之間的調控關系，本實驗通過分子生物學技術檢測發現，HOTTIP下調的細胞中EZH2的表達下降(圖5F)。免疫組化檢測發現，HOTTIP下調引起組織中EZH2和H3K27me3蛋白的表達稍有下降(圖6)，提示兩種蛋白均在癌基因HOTTIP的調控通路上，推測EZH2可能是HOTTIP的下游效應分子，通過改變甲基轉移酶H3K27me3的活性參與SCLC的惡性表型。

圖5 EZH2下調對細胞甲基轉移酶表達的影響：A.基于TP53突變狀態分析EZH2在肺鱗狀細胞癌中的表達；B.基于TP53突變狀態分析EZH2在肺腺癌中的表達；C.肺鱗狀細胞癌中EZH2啟動子區甲基化水平；D.肺腺癌中EZH2啟動子區甲基化水平；E.GSK-126梯度處理SCLC細胞后EZH2和H3K27me3蛋白的表達；F.HOTTIP下調后EZH2 mRNA的表達，*P<0.05

圖6 HOTTIP下調的細胞所成裸鼠瘤體組織中EZH2和H3K27me3蛋白表達，SP法

3 討論

2020年全球癌癥統計報告顯示，肺癌是最常見的癌癥死因，其病死率位居惡性腫瘤之首[1]。盡管SCLC的發病機制相當復雜，但基于表觀遺傳學機制的研究已取得較大進展[2]。近年研究發現，EZH2是PRC2上具有甲基轉移酶活性的催化核心結構，其通過介導組蛋白3上第27號賴氨酸發生三甲基化(H3K27me3)而介導轉錄抑制，從而在細胞增殖、周期調節及胚胎發育中起重要作用[5-6]。EZH2在實體腫瘤中表達通常會升高，如在胃癌、乳腺癌和肺癌中發揮致癌作用并與預后不良密切相關，并可抑制腫瘤細胞免疫逃逸和阻斷病毒感染[3,6-8]。

越來越多的證據表明，長鏈非編碼RNA可以在轉錄、轉錄后和翻譯后修飾等不同水平調控EZH2的表達及其甲基轉移酶活性[9-11]，另有一些長鏈非編碼RNA為EZH2的下游效應器，并有超過20%的長鏈非編碼RNA受到PRC2復合物的調控[12-14]。本組前期實驗發現關鍵基因HOTTIP啟動子區存在明顯的組蛋白甲基化修飾，HOTTIP通過調控H3K27me3促進了SCLC惡性轉化過程[4]。但HOTTIP是否介導EZH2的表達，參與甲基轉移酶活性調節和SCLC化療耐藥尚不清楚。

為明確EZH2與SCLC的關系，采用生物信息學技術分析EZH2在肺鱗狀細胞癌和肺腺癌中的表達及其與患者預后的相關性，結果發現其在肺腺癌中的表達較高且與患者預后不良相關。眾所周知，TP53是一種明星抑癌基因，該基因突變與腫瘤進展、轉移、化療耐藥和放療均有關，而且TP53突變者的無進展生存期縮短[15-18]。進一步分析TP53突變與EZH2的表達關系發現，在肺鱗狀細胞癌和肺腺癌中TP53突變者EZH2表達水平普遍較高，結果表明EZH2可能與肺癌患者預后不良密切相關。

研究結果提示，EZH2在SCLC多藥耐藥細胞株和SCLC組織中表達相對較高，表明EZH2可能與SCLC發生及耐藥密切相關；CCK-8實驗發現EZH2下調可能會抑制SCLC細胞的增殖并增強細胞對化療藥物的敏感性；流式細胞術檢測發現EZH2下調后G2期細胞數量明顯減少和細胞凋亡率增加，提示EZH2下調抑制SCLC細胞增殖很可能是通過干擾細胞G2期RNA及蛋白質的合成實現，而細胞凋亡可能是EZH2參與SCLC耐藥性產生的重要途徑。以上結果共同證實，EZH2可能參與SCLC的發生及其化療抗藥性的產生，而EZH2調控SCLC發生及耐藥的分子機制尚不清楚。

結合前期實驗，HOTTIP表達下調的細胞中EZH2表達下降，且HOTTIP下調的裸鼠皮下瘤體組織中EZH2和H3K27me3蛋白的表達下降，提示EZH2可能是HOTTIP發揮作用的下游分子，其可能通過改變甲基轉移酶活性參與SCLC細胞的增殖及化療耐藥過程。此外，EZH2的小分子抑制劑GSK-126在多個濃度均可抑制EZH2的表達，采用GSK-126或EZH2干擾質粒對基因表達的干擾作用趨勢一致。

上述結果提示，EZH2可能與SCLC的惡性表型密切相關，其可能作為長鏈非編碼RNA HOTTIP的效應分子，通過調控甲基轉移酶H3K27me3的活性參與SCLC發生、發展及化療耐藥過程。后續將開展延續性實驗，進一步分析EZH2在臨床SCLC組織中的作用及其與小鼠腫瘤發生及化療反應性的關系，以驗證其致癌作用。