肺腺癌胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中PD-L1的表達(dá)及其與臨床和分子特征的關(guān)系

王 蕊，劉 穎，郝佳璇，李 典，趙銀環(huán)，王 珩，杜 蕓

針對(duì)PD-1/PD-L1免疫調(diào)節(jié)軸的抗體在幾種惡性腫瘤治療中療效顯著，其中包括非小細(xì)胞肺癌[1]。腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的組織病理類型，惡性胸水是晚期肺腺癌患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥，因此，胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的合理使用在臨床工作中意義重大。腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達(dá)水平可用于預(yù)測(cè)免疫治療療效[2-4]，而PD-L1的免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)檢測(cè)是目前最經(jīng)濟(jì)且實(shí)用的方法。PD-L1檢測(cè)大多數(shù)集中在肺組織石蠟標(biāo)本中，胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本行免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry, ICC)檢測(cè)的應(yīng)用研究較少，且研究結(jié)果因?qū)嶒?yàn)室不同而存在差異[5]。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本及配對(duì)組織學(xué)標(biāo)本中PD-L1表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本ICC法檢測(cè)PD-L1的可行性，此外，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征和基因突變的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月～2021年10月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院診治的晚期肺腺癌患者63例，其中男性36例，女性27例；中位年齡60歲；影像學(xué)檢查排除其它部位病變轉(zhuǎn)移。收集的患者均未行放、化療、靶向治療或免疫抑制劑治療。此外，病例納入需符合：(1)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的腫瘤細(xì)胞量滿足常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷及ICC和分子檢測(cè)；(2)具備組織病理標(biāo)本，且腫瘤細(xì)胞數(shù)量滿足PD-L1檢測(cè)需要(>100個(gè))，包括手術(shù)肺葉或楔形切除19例、咬檢25例、經(jīng)支氣管超聲引導(dǎo)針吸活檢(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration, EBUS-TBNA)組織19例；(3)患者或其家屬均簽署知情同意書(shū)。本實(shí)驗(yàn)獲得河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞學(xué)標(biāo)本采集及胸水處理將>100 mL的胸水標(biāo)本分為兩部分，一部分使用一次性過(guò)濾膜將胸水全部過(guò)濾，涂片8～10張(2張用于HE染色，常規(guī)觀察，6～8張直接置于-20 ℃冰箱，用于RNA和DNA的提取)；一部分分次以2 500 r離心2 min，去除上清。將剩余的沉渣用10%中性福爾馬林固定4～12 h，取出后石蠟包埋，切片，用于ICC檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的ICC檢測(cè)及組織標(biāo)本的IHC檢測(cè)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本常規(guī)染色組合：TTF-1、Napsin A、p40、p63、Syn、CD56、WT-1、calretinin、CEA、PD-L1。PD-L1檢測(cè)使用羅氏Ventana PD-L1(SP263)兔單克隆抗體，操作在羅氏全自動(dòng)免疫組化儀(BENCHMARK?GX，羅氏)上進(jìn)行。根據(jù)FDA陽(yáng)性定義為：任何強(qiáng)度的全部胞膜或部分胞膜著色[6]。PD-L1表達(dá)按腫瘤比例評(píng)分(tumor proportion score, TPS)進(jìn)行判讀，TPS分為三類：<1%為不表達(dá)，1%～49%為低表達(dá)，TPS≥50%為高表達(dá)[7-8]。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師獨(dú)立判斷，結(jié)果不一致時(shí)重新判讀。

1.4 新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的多基因檢測(cè)刮取腫瘤細(xì)胞到EP管中，按照DNA/RNA雙提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA、RNA提取。分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度。OD260/OD280DNA濃度為1～2 ng/μL(說(shuō)明書(shū)1.5～3 ng/μL)。RNA原濃度上機(jī)檢測(cè)。用5種突變基因檢測(cè)試劑盒(廈門(mén)艾德公司)檢測(cè)ALK、ROS1、EGFR、KRAS、BRAF等基因突變，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用ABI7500全自動(dòng)定量PCR儀檢測(cè)。根據(jù)說(shuō)明書(shū)的判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線及CT值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本和組織學(xué)標(biāo)本中PD-L1 TPS的一致性使用Kappa系數(shù)評(píng)估，兩組之間的標(biāo)本比較采用McNemar-Bowker檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中PD-L1的表達(dá)及與臨床特征的相關(guān)性63例胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本均診斷為肺腺癌轉(zhuǎn)移，其中TTF-1和CEA的陽(yáng)性率為100%(63/63)，Napsin A陽(yáng)性率為98.4%(62/63)。22.2%(14/63)胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本標(biāo)本PD-L1 TPS≥50%，36.5%(23/63)1%～49%，41.3%(26/63)TPS<1%(圖1～3)。其余抗體未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞的特異性著色。最終病理結(jié)果均為腺癌。PD-L1表達(dá)與患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，而與患者吸煙史有關(guān)(P<0.05，表1)，尤其在PD-L1高表達(dá)(TPS≥50%)患者中吸煙比非吸煙患者的比例更高(44%vs14.8%)。

圖1 例1：A.細(xì)胞學(xué)涂片HE染色；B.TTF-1陽(yáng)性，Ventana法；C.PD-L1陰性，Ventana法 圖2 例2：A.細(xì)胞學(xué)涂片HE染色；B.TTF-1陽(yáng)性，Ventana法；C.PD-L1弱陽(yáng)性，Ventana法 圖3 例3：A.細(xì)胞學(xué)涂片HE染色；B.TTF-1陽(yáng)性，Ventana法；C.PD-L1強(qiáng)陽(yáng)性，Ventana法

2.2 胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本與配對(duì)組織學(xué)標(biāo)本中PD-L1的表達(dá)63例組織學(xué)標(biāo)本PD-L1表達(dá)：9例TPS≥50%，27例1%～49%，27例TPS<1%。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本與組織學(xué)標(biāo)本PD-L1表達(dá)的符合率為77.8%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。其中19例組織學(xué)標(biāo)本與細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的符合率為89.5%，25例活檢標(biāo)本的符合率為84.0%，EBUS-TBNA標(biāo)本的符合率為57.9%，三種組織學(xué)標(biāo)本與細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的PD-L1表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本與配對(duì)組織學(xué)標(biāo)本之間PD-L1表達(dá)具有高度一致性(Kappa=0.650，P<0.01)。此外，與組織學(xué)標(biāo)本相比，胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本在PD-L1高表達(dá)組(TPS≥50%)具有更高的陽(yáng)性率(22.2%vs14.3%)。

2.3 胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本基因突變狀態(tài)與PD-L1表達(dá)的關(guān)系63例胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本基因突變狀態(tài)：EGFR突變31例(G719X+L861Q突變1例，19外顯子缺失17例，21號(hào)外顯子L858R突變12例，18號(hào)外顯子G719X突變1例)；BRAF突變1例；ALK融合2例；Ras突變4例(表3)。其中EGFR突變(31例)與無(wú)基因突變(25例)患者的PD-L1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 63例肺腺癌患者胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中PD-L1的表達(dá)與臨床特征、EGFR基因突變的關(guān)系

表2 63例肺腺癌胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本與配對(duì)的肺組織學(xué)標(biāo)本中PD-L1表達(dá)對(duì)比分析[n(%)]

表3 少見(jiàn)基因突變病理胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本PD-L1的表達(dá)

3 討論

在最新肺癌診療指南[9]中，專家組一致推薦對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌，與驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)同樣重要的是PD-L1表達(dá)情況。許多晚期肺腺癌患者失去最佳手術(shù)機(jī)會(huì)，而胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本因其取材方便、可重復(fù)性高，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。國(guó)外有研究證實(shí)[10-12]，細(xì)胞學(xué)涂片同樣可以應(yīng)用于PD-L1檢測(cè)。然而，本組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)胸水細(xì)胞涂片及細(xì)胞石蠟的ICC檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，涂片細(xì)胞ICC有背景著色、染色不均、相對(duì)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，而細(xì)胞蠟塊切片相對(duì)彌補(bǔ)了上述缺點(diǎn)，且聯(lián)合TTF-1和Napsin A染色可對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行定位，更易于計(jì)數(shù)、TPS評(píng)分等。此外，有研究已經(jīng)證明蠟塊存放時(shí)間越長(zhǎng)，PD-L1表達(dá)越弱[13]，本組所有蠟塊均未經(jīng)過(guò)存放，消除了這一影響。同時(shí)，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，采用新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行肺癌多基因檢測(cè)[14]。

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格控制入組條件，納入研究對(duì)象均滿足ICC、IHC及分子檢測(cè)的要求。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PD-L1胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本ICC檢測(cè)與肺組織IHC檢測(cè)具有高度一致性。Heymann等[15]比較了細(xì)胞學(xué)標(biāo)本和石蠟標(biāo)本中PD-L1的表達(dá)，一致性達(dá)91%，證實(shí)了細(xì)胞學(xué)標(biāo)本同樣可用于PD-L1的檢測(cè)，但只有12例標(biāo)本來(lái)自胸腔積液和心包積液。Xu等[16]的研究結(jié)果表明，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間PD-L1表達(dá)的一致性較低(Kappa值=0.455)；Zou等[5]回顧性分析了胸水細(xì)胞學(xué)石蠟標(biāo)本與配對(duì)組織學(xué)石蠟標(biāo)本的PD-L1表達(dá)，表明胸水細(xì)胞學(xué)蠟塊中PD-L1表達(dá)明顯高于配對(duì)組織學(xué)石蠟標(biāo)本，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，盡管如此，在總的組織學(xué)標(biāo)本與細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的一致性研究中，證明了兩者的高度一致性(Kappa值=0.774)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在PD-L1表達(dá)上，胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本與組織學(xué)標(biāo)本之間的符合率較高，尤其是在肺葉切除或楔形切除標(biāo)本中，雖然EBUS-TBNA標(biāo)本與細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的符合率僅有57.9%，考慮病例數(shù)較少的原因，但兩者間差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究[17]證實(shí)免疫微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的作用可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本在PD-L1高表達(dá)組(TPS≥50%)具有更高的陽(yáng)性率。作者推測(cè)免疫微環(huán)境對(duì)結(jié)果的影響起關(guān)鍵作用。

許多研究涉及PD-L1表達(dá)與肺癌臨床特征的關(guān)系，但是與EGFR優(yōu)勢(shì)人群界定不同，目前對(duì)于PD-L1高表達(dá)人群的界定仍然未達(dá)成共識(shí)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PD-L1表達(dá)與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)關(guān)，而與吸煙史有關(guān)，吸煙患者中PD-L1呈高表達(dá)。Montero等[18]的研究納入了482例非小細(xì)胞肺癌的福爾馬林石蠟包埋標(biāo)本，證實(shí)PD-L1表達(dá)與患者年齡和性別無(wú)關(guān)，但并未分析吸煙狀態(tài)與PD-L1表達(dá)的關(guān)系。Pan等[19]評(píng)估了108 例手術(shù)切除肺鱗狀細(xì)胞癌和221例肺腺癌組織中PD-L1的表達(dá)，證實(shí)PD-L1在男性、吸煙人群中高表達(dá)。一項(xiàng)多中心回顧性研究[20]對(duì)189例肺癌相關(guān)基因陽(yáng)性患者進(jìn)行分析，表明在這些患者的相關(guān)臨床特征中，吸煙狀態(tài)最為重要，是易獲得單一的免疫抑制劑療效的預(yù)測(cè)因子，該研究也證實(shí)了KRAS基因突變患者PD-L1表達(dá)更高。

有研究表明EGFR突變患者的PD-L1陽(yáng)性率低[21]，也有研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者的PD-L1表達(dá)升高[22]。Kim等[23]的研究結(jié)果亦表明，EGFR突變與PD-L1表達(dá)無(wú)相關(guān)性。這些研究均采用的是肺組織石蠟標(biāo)本。Mei等[24]利用細(xì)胞學(xué)標(biāo)本研究PD-L1表達(dá)與EGFR突變無(wú)關(guān)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)KRAS突變與PD-L1表達(dá)相關(guān)，即PD-L1陽(yáng)性和PD-L1強(qiáng)陽(yáng)性(≥50%)標(biāo)本中KRAS突變率高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證明，EGFR突變與PD-L1表達(dá)無(wú)關(guān)，但本組KRAS基因突變僅4例，病例數(shù)太少未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

肺癌組織學(xué)標(biāo)本PD-L1檢測(cè)具有異質(zhì)性，這種異質(zhì)性與組織學(xué)類型可能有關(guān)，有研究表明小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中PD-L1表達(dá)普遍存在異質(zhì)性[6]，與肺鱗狀細(xì)胞癌相比，在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中，肺腺癌PD-L1表達(dá)顯示出更高的一致性[15]。本實(shí)驗(yàn)的觀察對(duì)象均為形成大量胸水的肺腺癌患者，考慮可能這類患者普遍的異質(zhì)性較低，具有較高一致性，但這一想法需要更多、更大量數(shù)據(jù)的研究進(jìn)行證明。

綜上所述，肺腺癌胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中PD-L1表達(dá)與肺組織學(xué)標(biāo)本具有較高的一致性，能夠較好的反應(yīng)肺組織學(xué)標(biāo)本的PD-L1表達(dá)狀態(tài)。此外，胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、省時(shí)、微創(chuàng)、可重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于晚期肺腺癌患者細(xì)胞學(xué)標(biāo)本合理、有效的應(yīng)用，除了能夠預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1藥物的療效外，還可以動(dòng)態(tài)檢測(cè)PD-L1表達(dá)，從而指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療。