缺氧環境下miR-143-5p/HIF-1α信號軸調控人牙髓干細胞促血管生成潛能的機制研究

孟紫君，何 璇，龐彩鳳，劉春萍，黃春艷，陳文霞

牙髓是高度血管化的組織，被堅硬的無讓性牙本質包圍，血管、神經、淋巴管僅通過狹窄的根尖孔與根尖周組織相連，這種獨特的解剖結構使牙髓在受到損傷后易發生缺血缺氧甚至感染壞死[1]。傳統的根管治療會導致牙齒變脆，增加根折的風險。人牙髓干細胞是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的干細胞，能夠再生受損的細胞和牙髓-牙本質復合體，基于干細胞移植的組織工程技術是牙髓疾病理想的治療方式[2]。組織工程技術的成功依賴于良好血管網絡的建立，這對維持牙髓組織的活力和功能至關重要。而如何提高干細胞的血管生成潛能，以有效再生功能性牙髓組織是臨床上尚未解決的難題。有研究表明，缺氧環境能夠提高干細胞的促血管生成潛能，主要是通過上調缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)，從而激活HIF-1α/血管內皮生長因子(VEGF)途徑來調節VEGF的表達和分泌[3]，但具體的轉錄后調控機制尚未明確。miRNA是一類長度為17～24個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體降解mRNA或阻礙其翻譯過程，從而調節基因表達[4]。miR-143-5p作為干細胞功能和分化的重要調節因子，參與調控干細胞向牙本質分化和缺氧環境下的血管生成[5-6]。基因數據庫分析和雙熒光素酶報告實驗表明，HIF-1α為miR-143-5p靶基因之一[7]，但低氧環境下miR-143-5p對人牙髓干細胞促血管生成潛能的調控作用尚不清楚。本研究以人牙髓干細胞作為體外實驗對象，觀察miR-143-5p對氯化鈷誘導化學缺氧人牙髓干細胞生物學活性和促血管生成潛能的影響，并探討miR-143-5p/HIF-1α信號軸在其中的作用。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器 胎牛血清、DMEM高糖培養基、胰蛋白酶(Gibco，美國)；青霉素鏈霉素混合液(索萊寶，中國)；氯化鈷六水合物(Sigma，美國)；過表達miR-143-5p慢病毒(miR-143-5p mimics)載體、過表達陰性對照(mimics-NC)載體、沉默miR-143-5p慢病毒(miR-143-5p inhibitor)載體、沉默陰性對照(inhibitor-NC)載體(吉凱基因，中國)；PCR試劑盒(Takara，中國)；鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人HIF-1α多克隆抗體(Elabscience，中國)；山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(Invitrogen，美國)；CCK-8試劑盒(Dojindo，中國)；BCA試劑盒(碧云天，中國)；ELISA試劑盒(Elabscience，中國)。

1.2實驗方法

1.2.1人牙髓干細胞體外分離與培養：采用組織塊培養法培養人牙髓干細胞。經廣西醫科大學倫理委員會批準，臨床收集15～25歲因正畸需要拔除的健康前磨牙，受試者及家屬均知情同意。在無菌環境下劈開牙齒，取出牙髓組織。用眼科剪將牙髓剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，均勻的鋪在培養瓶底部，然后加入高糖DMEM培養基(含20%胎牛血清，1%青鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養。每3 d換液1次，至細胞生長至80%融合時用0.25%胰酶消化，以1∶3傳代。取生長狀態良好的第3～5代人牙髓干細胞用于后續實驗。

1.2.2流式細胞儀檢測人牙髓干細胞表面標志物：人牙髓干細胞生長至80%～90%融合后，用胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次后，將細胞濃度調整為3×106/ml；兩支流式樣品管各取100 μl的細胞懸液，在陽性管內依次加入20 μl的CD45、CD29、CD34、CD90抗體，陰性管內加入80 μl的PBS溶液，冰上避光孵育30 min。PBS洗脫未結合的抗體，上流式細胞儀檢測。

1.2.3氯化鈷構建體外細胞化學缺氧模型：配制含不同濃度氯化鈷的DMEM培養液處理人牙髓干細胞24 h或48 h，根據氯化鈷終末濃度將實驗組分為50、100、200 μmol/L組，對照組氯化鈷終末濃度為0 μmol/L。利用氯化鈷的化學特性，模擬體外細胞缺氧環境。

1.2.4CCK-8法檢測人牙髓干細胞增殖能力：將人牙髓干細胞以3000個每孔接種于96孔板中，待細胞貼壁后，棄上清，根據上述分組加入100 μl含不同濃度氯化鈷的培養液，分別培養24 h和48 h。向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液，在培養箱中繼續孵育2 h。酶標儀檢測各組在450 nm處的吸光度值。

1.2.5Transwell小室實驗檢測人牙髓干細胞遷移能力：取生長狀態良好的人牙髓干細胞，胰蛋白酶消化后，用無血清DMEM培養液重懸細胞，往上室每孔加入200 μl(1×105/ml)單細胞懸液，根據上述分組在下室加入700 μl含不同濃度氯化鈷的完全培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。取出Transwell小室，4%多聚甲醛室溫下固定20 min。用棉簽擦去小室微孔膜上層細胞，0.1%結晶紫染色30 min。雙蒸水漂洗，顯微鏡下觀察并記錄遷移細胞數量。

1.2.6人牙髓干細胞miR-143-5p及血管生成相關基因mRNA表達水平檢測：Trizol法提取細胞總RNA，檢測總RNA的純度和濃度。使用逆轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)擴增反應。miR-143-5p內參為U6，HIF-1α、VEGF內參為β-actin。采用2-ΔΔCt法分析目的基因表達情況。引物序列見表1。

1.2.7Western Blot檢測氯化鈷對人牙髓干細胞表達HIF-1α的影響：將細胞充分裂解，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉移至PVDF膜，封閉液封閉15 min，TBST洗滌5次，每次5 min。加入一抗HIF-1α(1∶1000)、β-actin(1∶2000)在4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗滌5次。分別加入山羊抗兔(1∶5000)和山羊抗鼠二抗溶液(1∶10000)室溫下孵育1 h；洗膜，ECL顯色，暗室曝光。ImageJ分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8ELISA檢測氯化鈷對人牙髓干細胞表達VEGF的影響：實驗組和對照組人牙髓干細胞分別培養24 h和48 h后，取上清液，用ELISA試劑盒檢測培養上清液中VEGF的濃度。ELISA檢測方法嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行。

1.2.9構建慢病毒載體過表達或沉默人牙髓干細胞miR-143-5p：將人牙髓干細胞接種于6孔板中，待細胞生長至30%～50%融合時，按照吉凱基因慢病毒轉染操作說明書分別轉染miR-143-5p mimics、mimics-NC、miR-143-5p inhibitor、inhibitor-NC載體至人牙髓干細胞。12 h后更換新鮮培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養72 h。倒置熒光顯微鏡觀察慢病毒載體轉染效率，qRT-PCR檢測人牙髓干細胞miR-143-5p與成血管生成相關基因mRNA表達水平。

2 結果

2.1人牙髓干細胞的分離培養 倒置顯微鏡下觀察，原代培養3～7 d后人牙髓干細胞從組織塊邊緣爬出，呈長梭形、紡錘樣形態，有少量細胞突起。見圖1a。14～20 d后人牙髓干細胞基本長滿瓶底，以胰蛋白酶消化傳代。傳代的細胞密度顯著增加，表現為集落樣克隆增長，呈放射狀或旋渦狀排列。見圖1b。

表1 miR-143-5p及血管生成相關基因引物序列

圖1 人牙髓干細胞的原代培養

1a.人牙髓干細胞原代培養第5天(×40)；1b.第3代人牙髓干細胞(×100)

2.2人牙髓干細胞表面標志物鑒定 流式細胞儀檢測培養細胞的表面標志物，其中CD29(100.00%)和CD90(98.50%)呈陽性表達；造血干細胞表面標志物CD34(0.43%)和CD45(0.15%)呈陰性表達；符合間充質干細胞的表面抗原特征，表明培養的細胞為人牙髓干細胞。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測人牙髓干細胞表面標志物

2.3不同濃度氯化鈷處理對人牙髓干細胞增殖能力的影響 CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，在培養24 h和48 h后，50 μmol/L組和100 μmol/L組細胞增殖活性明顯高于對照組(P<0.01)。200 μmol/L組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 不同濃度氯化鈷對人牙髓干細胞增殖的影響

2.4不同濃度氯化鈷處理對人牙髓干細胞遷移能力的影響 Transwell小室實驗檢測細胞遷移結果顯示，50 μmol/L組、100 μmol/L組和200 μmol/L組細胞遷移能力均高于對照組，且100 μmol/L組和200 μmol/L組高于50 μmol/L組(P<0.01)。見圖4。

圖4 不同濃度氯化鈷對人牙髓干細胞遷移能力的影響(×100)

2.5miR-143-5p及HIF-1α、VEGF mRNA在缺氧誘導人牙髓干細胞的表達 qRT-PCR檢測結果顯示，在缺氧環境下培養48 h后，50 μmol/L組、100 μmol/L組和200 μmol/L組miR-143-5p表達量較對照組明顯降低，并隨氯化鈷濃度的升高而降低(P<0.01)。相反，50 μmol/L組、100 μmol/L組和200 μmol/L組HIF-1α mRNA表達水平較對照組顯著升高，且200 μmol/L組較100 μmol/L組顯著升高(P<0.01)。100 μmol/L組和200 μmol/L組VEGF mRNA表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)。見圖5。

圖5 不同濃度氯化鈷處理對人牙髓干細胞miR-143-5p及成血管生成相關基因表達的影響

2.6不同濃度氯化鈷處理對人牙髓干細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達的影響 在氯化鈷誘導48 h后，人牙髓干細胞中HIF-1α蛋白水平隨氯化鈷濃度的增加逐漸升高，100 μmol/L組和200 μmol/L組HIF-1α蛋白表達水平較對照組明顯升高(P<0.01)。見圖6a、6b。ELISA檢測結果顯示，培養24 h和48 h后，100 μmol/L組和200 μmol/L組細胞培養上清液中VEGF水平顯著高于對照組(P<0.05，P<0.01)，并隨時間的延長和氯化鈷濃度的增加而增加。見圖6c。

圖6 不同濃度氯化鈷處理對人牙髓干細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達水平的影響

2.7miR-143-5p對人牙髓干細胞HIF-1α、VEGF mRNA表達的影響 用慢病毒載體過表達或沉默人牙髓干細胞中miR-143-5p，并檢測HIF-1α、VEGF mRNA水平。熒光顯微鏡觀察與qRT-PCR結果顯示，轉染miR-143-5p mimics人牙髓干細胞miR-143-5p表達較轉染mimics-NC明顯升高(P<0.01)，表明慢病毒載體介導的miR-143-5p轉染有較高的轉染效率。與轉染mimics-NC比較，轉染miR-143-5p mimics人牙髓干細胞HIF-1α、VEGF mRNA表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與轉染inhibitor-NC比較，轉染miR-143-5p inhibitor人牙髓干細胞HIF-1α和VEGF mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)。表明miR-143-5p能夠負向調控HIF-1α/VEGF水平，促進人牙髓干細胞的旁分泌血管生成活性。見圖7。

3 討論

由于牙髓腔解剖結構的特殊性，缺氧是牙髓內常見的環境應激因素，由生物或機械刺激引起的牙髓炎癥可使組織間液壓力增加導致細胞缺氧[8]。研究表明，缺氧可以誘發牙源性干細胞增殖、血管生成和礦化等反應[9-11]。氯化鈷作為一種化學物質，其中的二價鈷離子能夠有效抑制細胞內HIF-1α的降解，被廣泛應用于細胞缺氧模型的研究[12]。本實驗研究結果發現，在氯化鈷誘導的化學缺氧環境下，50 μmol/L和100 μmol/L的氯化鈷能夠促進人牙髓干細胞的增殖，而50 μmol/L、100 μmol/L與200 μmol/L的氯化鈷能使細胞遷移能力明顯增強，表明適宜的缺氧刺激能夠顯著提高人牙髓干細胞的生物學活性，這對于干細胞遷移到損傷部位參與牙髓組織修復再生具有重要意義。

圖7 miR-143-5p在缺氧環境下對人牙髓干細胞HIF-1α、VEGF mRNA表達的影響

缺氧被認為是刺激牙髓內血管生成的重要因素。細胞在缺氧時能夠適應缺氧環境并觸發血管生成反應，與細胞內升高的HIF-1α表達相關[13]。HIF-1α是細胞適應缺氧的關鍵蛋白質轉錄調節因子，在常氧條件下HIF-1α被脯氨酸羥化酶羥基化，進一步通過泛素化途徑降解；缺氧狀態下脯氨酸羥化酶被抑制，使HIF-1α累積，進入細胞核后啟動并參與細胞代謝、紅細胞生成和血管生成(如VEGF)等下游基因的轉錄，共同調節細胞對缺氧的適應性反應[14]。本研究結果發現，隨著氯化鈷濃度的增加，HIF-1α和VEGF mRNA與蛋白表達水平逐漸升高，特別是在200 μmol/L氯化鈷缺氧誘導條件下，二者的表達與對照組比較差異更加顯著。眾所周知VEGF是最重要的促血管生成活性生長因子，能有效誘導內皮細胞增殖、遷移、存活及分化為新生血管[15]。證實了缺氧環境下人牙髓干細胞的旁分泌促血管生成活性顯著增強。

miRNA是一類內生的、高度保守的小分子非編碼RNA，具有細胞和組織特異性，在調控基因表達、細胞周期、生物體發育時序等方面起重要作用。此外，miRNA還參與了干細胞生物學過程，涉及細胞周期、干性維持和分化調節[16]。而miR-143-5p由于能夠調控數百個基因表達而受到廣泛關注。研究表明，miR-143-5p參與調控干細胞向內皮分化和通過旁分泌作用的方式促進內皮細胞血管生成，如長鏈非編碼RNA TUG1通過調節miR-143/FGF1軸促進脂肪來源干細胞的內皮分化[17]；GENG等[18]研究發現，心肌梗死患者冠狀動脈血清來源的外泌體能通過miRNA-143/IGF-IR途徑促進人臍靜脈內皮細胞血管生成。此外，miR-143-5p通過負向調控靶基因HIF-1α表達水平促進腫瘤的血管生成，從而加快腫瘤的侵襲和轉移[7]。但缺氧環境下人牙髓干細胞是否表達miR-143-5p，以及miR-143-5p是否通過HIF-1α/VEGF軸調節缺氧環境下人牙髓干細胞的促血管生成潛能尚不清楚。

本研究首先通過qRT-PCR證實了miR-143-5p在缺氧環境下人牙髓干細胞中表達下調，說明缺氧能夠引起miR-143-5p表達的變化。然后探討缺氧環境下人牙髓干細胞中miR-143-5p是否通過調控HIF-1α表達水平促進了細胞的旁分泌促血管生成活性。本研究發現，缺氧環境下miR-143-5p隨氯化鈷濃度的增加其表達逐漸下調，而HIF-1α、VEGF mRNA表達水平則在氯化鈷誘導后逐漸增高，二者呈反向變化關系。進一步慢病毒載體轉染實驗結果顯示，過表達miR-143-5p能顯著降低人牙髓干細胞中HIF-1α和VEGF mRNA表達水平，而抑制人牙髓干細胞miR-143-5p的表達后，HIF-1α和VEGF mRNA表達則明顯升高。表明缺氧環境下miR-143-5p通過負向調控HIF-1α mRNA的表達來促進人牙髓干細胞分泌VEGF的能力，從而提高缺氧環境下人牙髓干細胞的促血管生成潛能。

綜上所述，氯化鈷誘導的缺氧環境促進了人牙髓干細胞的增殖、遷移和促血管生成潛能等生物學特性，而miR-143-5p/HIF-1α信號軸可能參與了缺氧環境下對人牙髓干細胞旁分泌促血管生成活性的調節。本實驗為缺氧環境下人牙髓干細胞促血管生成潛能的分子機制相關研究提供了參考，但詳細機制尚需通過進一步體外內皮細胞血管形成實驗和體內動物實驗來驗證。