芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的網絡藥理學研究

劉甜甜,劉 鑫,張彥麗,何 婷,曹俊嶺

糖尿病合并冠心病心絞痛屬中醫(yī)消渴并發(fā)胸痹、心痛等范疇[1],其基本病機主要是本虛標實、氣虛血瘀,故益氣活血化瘀、標本同治為其重要治則。芪參益氣滴丸是益氣活血法的代表方藥,常用于氣虛血瘀型冠心病心絞痛的治療,該方由黃芪、丹參、三七、降香4味中藥組成,具有益氣活血、化瘀通脈、寧心止痛之功效。研究證實芪參益氣滴丸可以治療2 型糖尿病合并冠心病、心肌梗死、冠狀動脈微血管病變、慢性心力衰竭等心系疾病[2-5]。而關于芪參益氣滴丸干預糖尿病合并冠心病心絞痛的作用機制報道較少,本研究借助網絡藥理學方法建立芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的“中藥-活性成分-作用靶點-信號通路”關系網絡,從中醫(yī)整體角度探討芪參益氣滴丸干預糖尿病合并冠心病心絞痛的藥理機制。

1 資料與方法

1.1 搜索芪參益氣滴丸活性成分及靶點 利用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫分析平臺(TCMSP)檢索黃芪、丹參、三七、降香的活性成分,設置篩選參數為口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18,檢索芪參益氣滴丸的活性成分。使用 TCMSP 數據庫和DrugBank 數據庫獲得相應活性成分的靶點,通過STRING 數據庫將蛋白名批量轉化為基因名,采用UniProt 數據庫進行基因名校準。

1.2 繪制“活性成分-靶點”網絡圖 利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制芪參益氣滴丸“活性成分-靶點”網絡圖,進行網絡拓撲參數分析,計算度值(Degree),選出大于平均Degree 值2 倍的主要活性成分。

1.3 檢索糖尿病合并冠心病心絞痛的靶點 在DisGeNET 數據庫中分別檢索“糖尿病”“冠心病”“心絞痛”的相關靶基因,對冠心病和心絞痛靶點合并去重后與糖尿病靶點取交集,獲得疾病靶基因。

1.4 構建蛋白互作(PPI)網絡圖 利用FunRich_V3軟件繪制韋恩圖,得到芪參益氣滴丸與糖尿病合并冠心病心絞痛相交的作用靶點。將相交靶基因導入STRING 數據庫,將生物種類設為“Homo sapiens”,最低相互作用置信度得分設為“high confidence”(0.7),簡化顯示設為“隱藏網絡中斷開連接的節(jié)點”,其他參數保持默認,得到基因/蛋白相互作用網絡數據,將數據以文本格式導入Cytoscape 3.7.2 軟件,構建PPI 網絡,基于網絡拓撲參數獲得degree 值較高的核心靶點。

1.5 解析靶點基因本體(GO)生物功能和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路 應用DAVID 數據庫進行相交靶基因的生物過程、分子功能、細胞組分和KEGG通路富集分析,依據錯誤發(fā)現率Benjamini＜0.05,選出差異顯著的生物過程、分子功能、細胞組成和信號通路。采用Cytoscape 軟件繪制“中藥-活性成分-作用靶點-信號通路”網絡圖。

2 結 果

2.1 整合芪參益氣滴丸的活性成分和靶點 以OB≥30%且DL≥0.18 為設置參數,在TCMSP 數據庫檢索到:黃芪活性成分17 個,作用靶點462 個;丹參活性成分59 個,作用靶點932 個;三七活性成分7 個,作用靶點253 個;降香活性成分32 個,作用靶點620 個。對4 味中藥的活性成分和作用靶點進行合并去重后得到芪參益氣滴丸的活性成分110 個和作用靶點255 個。

2.2 芪參益氣滴丸活性成分-靶點網絡 通過Cytoscape 軟件構建芪參益氣滴丸的“活性成分-靶點”網絡圖,圖中藍色正邊形代表方藥,紅色矩形代表中藥,綠色六邊形代表活性成分,黃色圓形代表作用靶點,見圖1。由網絡拓撲參數分析得到371 個節(jié)點、2 386條邊,平均Degree 值為12.897,大于平均Degree 值2倍的化合物有31 個,如槲皮素、芒柄花黃素、β-谷甾醇、山奈酚、木犀草素、丹參酮、異鼠李素、二氫丹參內酯、異隱丹參酮、豆甾醇等。詳見表1。

圖1 芪參益氣滴丸活性成分及靶點

表1 芪參益氣滴丸31 個活性成分及其Degree 值

2.3 芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的靶點 在DisGeNET 數據庫檢索獲得糖尿病靶點3 134 個、冠心病靶點1 576 個、心絞痛靶點139 個,對冠心病、心絞痛合并去重后得到冠心病心絞痛靶點1 612 個,對糖尿病和冠心病心絞痛靶點取交集,獲得935 個疾病靶點,見圖2。對芪參益氣滴丸的255 個活性成分靶點和935 個疾病靶點取交集,得到106 個相交靶點,見圖3。

圖2 冠心病心絞痛-糖尿病相交靶點韋恩圖

圖3 芪參益氣滴丸-疾病相交靶點韋恩圖

2.4 藥物-疾病相交靶點PPI 網絡分析 將106 個相交靶點導入STRING 數據庫,獲取蛋白互作數據,將數據導入Cytoscape 軟件進行拓撲參數分析,得到100個節(jié)點、711 條邊,平均介數(betweenness centrality)為0.013,平均接近中心性(closeness centrality)為0.453,平均最短路徑長度(average shortest path length)為2.278,平均Degree 值為14.22。選擇Degree 值19～48 的靶點進行子網絡提取,獲得30 個核心靶點的PPI 網絡,紅色越深表示Degree 值越大,說明其參與的生物功能越多,在網絡中心越重要。采用Cytoscape 3.7.2軟件中的MCODE 插件對核心靶點進行網絡聚類分析,依據得分高低選出聚類較好的基因,主要分為3 個模塊聚類群,模塊1 得分為11.733,參與的生物過程有炎癥反應、免疫應答、RNA 聚合酶轉錄調控、T 細胞增殖調節(jié)、缺氧反應等。模塊2 得分為7.556,參與的生物過程有凋亡信號通路調控、細胞對缺氧的反應、血管生成、細胞增殖等。模塊3 得分為4.800,主要參與代謝過程。詳見圖4。

圖4 芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛靶點的PPI 網絡

2.5 藥物-疾病相交靶點生物功能和通路富集分析將106 個相交靶點導入DAVID 數據庫,根據錯誤發(fā)現率Benjamini＜0.05,得到生物過程(BP)205 個、分子功能(MF)38 個、細胞組分(CC)19 個。生物過程主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正調控、凋亡過程負調控、細胞增殖的正調控、炎癥反應、缺氧反應、血管生成等。分子功能主要包括蛋白質結合、酶結合、轉錄因子活性、轉錄因子結合、細胞因子活性等。細胞組分主要分布于質膜、細胞外間隙、胞漿、胞外體、線粒體、內質網膜等。選出基因條目數排名前10 位的生物過程、分子功能、細胞組分繪制柱形圖。詳見圖5。

圖5 芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛靶點的GO 功能分析

采用DAVID 數據庫對106 個相交靶點進行KEGG 通路富集分析,依據Benjamini＜0.05 得到84個條目,排除共性通路后,得到差異顯著的20 條通路,詳見圖6。KEGG 通路富集結果顯示,靶基因主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)、低氧誘導因子-1(HIF-1)、腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)、核轉錄因子-κB(NF-κB)、血管內皮生長因子(VEGF)、細胞凋亡、p53、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)等通路上。采用Cytoscape 軟件繪制“藥物-活性成分-核心靶點-信號通路”網絡(見圖7),紅色正方形代表方劑,藍色六邊形代表單味中藥,綠色菱形代表活性成分,黃色圓形代表核心靶點,深黃色三角形代表信號通路,結果表明,芪參益氣滴丸主要通過102 個活性成分作用于106 個靶點的20 條信號通路治療糖尿病合并冠心病心絞痛。

圖6 芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的靶點通路

圖7 芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的活性成分-靶點-信號通路網絡

3 討 論

本研究基于網絡藥理學和生物信息學方法初步證實了芪參益氣滴丸中的槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹參酮ⅡA、丹參酮、異鼠李素、異隱丹參酮、豆甾醇、隱丹參酮、異丹參酮Ⅱ、丹參新酮等成分是發(fā)揮療效的關鍵物質基礎。這些活性物質作用于106 個靶點上的PI3K-Akt、HIF-1、腫瘤壞死因子(TNF)、叉頭框轉錄因子O(FoxO)、Toll 樣受體、MAPK、NF-κB、NOD 樣受體、Janus 激酶(JAK)-信號轉導及轉錄激活因子(STAT)、趨化因子、VEGF、細胞凋亡、p53、PPAR 等信號通路發(fā)揮抑制細胞凋亡、促進血管新生、降低氧化損傷的作用。

通過構建芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的“中藥-活性成分-作用靶點”網絡,發(fā)現芪參益氣滴丸的4 味中藥共有110 個活性化合物,其中,Degree 值較大的31 個活性成分是主要藥效基質。研究發(fā)現,槲皮素能顯著抑制NOD 樣受體蛋白 3(NLRP3)炎癥小體激活,降低炎癥反應,從而減輕糖尿病大鼠心肌損傷,具有防治冠心病、抑制血栓形成作用[6-8]。木犀草素可以保護小鼠急性心肌梗死后心肌細胞缺血損傷[9],也能降低糖尿病小鼠心肌凋亡,減輕糖尿病心肌損傷[10],還能降低炎癥、抗氧化應激、改善脂代謝紊亂[11-12]。丹參酮類物質可以改善心肌缺血再灌注損傷,抑制血管內皮功能障礙,抗血小板聚集,減少平滑肌細胞增殖遷移,可用于糖尿病血管并發(fā)癥治療[13-16]。本研究證實芪參益氣滴丸中的槲皮素、木犀草素、丹參活性物質是治療糖尿病合并冠心病心絞痛的活性成分。

PI3K-Akt 是細胞內重要信號轉導通路,其下游效應分子有促進血管新生、抑制心肌凋亡作用[17]。最新研究發(fā)現芪參益氣滴丸能通過激活PI3K/Akt 信號通路,減輕小型豬心肌缺血再灌注損傷[4]。由于持續(xù)高血糖可引起心臟血管內皮和心肌細胞氧化應激、炎性損傷致使心臟結構和功能改變。高糖及糖尿病時發(fā)生胰島素抵抗,蛋白激酶C(PKC)被激活,進而降低PI3K、Akt、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性,使eNOS 脫偶聯增加,一氧化氮(NO)生成減少,引起內皮細胞損傷。體內過多的活性氧(ROS)激活NF-κB信號通路促使炎性因子表達上調,導致單核細胞黏附、聚集,在亞內皮層形成泡沫細胞滲出,導致平滑肌細胞增殖,加速心臟血管損傷[18]。當組織缺血缺氧時,HIF-1 表達增多,引起VEGF 上調。VEGF 激活后招募內皮細胞到缺氧區(qū)域,刺激局部形成新的毛細血管,從而在一定程度上緩解組織缺血缺氧損傷。另外,HIF-1也能使骨髓來源的內皮細胞血管新生作用明顯受損[19]。心肌缺血再灌注損傷和心肌梗死治療主要是通過增加NO 合成促進血管再生[20],而細胞內的環(huán)磷酸鳥苷酸(cGMP)-環(huán)磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶(PKG)、MAPK、HIF-1 信號都能影響NO 產生[21-22]。此外,MAPK 信號通路與糖尿病心肌病的氧化應激損傷、炎癥反應、心肌凋亡密切相關[1],多數益氣活血中藥可通過下調MAPK 磷酸化活性和蛋白表達,抑制MAPK 信號通路,降低過氧化物和炎性因子水平,減輕心肌凋亡,從而改善心功能[23]。綜合文獻分析和KEGG 通路富集結果表明,芪參益氣滴丸可能通過激活PI3K-Akt 和VEGF,同時抑制TNF、MAPK、NF-κB、p53 等信號通路增加NO 合成,促進血管再生,抑制心臟炎癥和氧化應激,降低心肌凋亡,從而達到治療糖尿病合并冠心病心絞痛的目的。

本研究初步探討芪參益氣滴丸治療糖尿病合并冠心病心絞痛的藥理機制,構建了藥物-活性成分-作用靶點-信號通路交互網絡,篩選出110 個潛在活性成分和106 個作用靶點,其中,20 個信號通路可能與藥物治療糖尿病合并冠心病心絞痛相關,為后續(xù)深入研究芪參益氣滴丸的療效機制提供了一定的理論基礎。