線粒體ATP 敏感性鉀離子通道開放劑對冠心病大鼠血管內皮損傷的影響及相關機制研究

伊加提·司馬義,帕合熱丁·努爾麥麥提,阿布都乃比·麥麥提艾力

冠心病是冠狀動脈功能性或器質性病變導致的一類心臟病,病人冠狀動脈供血和心肌需求平衡紊亂,心肌合并不同程度缺血、缺氧表現[1]。有研究指出,血脂代謝異常和血管內皮功能損傷是影響冠心病發生的主要因素,同時也是影響冠心病病人預后及不良心血管事件的主要因素[2-3]。因此,改善血脂水平、緩解血管內皮損傷是目前治療冠心病的關鍵所在。線粒體ATP敏感性鉀離子通道(mito-KATP)開放劑是一種用于緩解心肌缺血再灌注損傷的心肌保護藥物,可通過作用于心肌及血管平滑肌上的mito-KATP,調節鉀離子內流情況,促進線粒體氧化磷酸化及ATP 的產生[4]。二氮嗪作為mito-KATP 開放劑,已經被證明具有對抗心肌損傷的作用,但其在冠心病中對血管內皮損傷的作用及機制尚不明確[5]。本研究通過構建冠心病模型大鼠,于實驗動物體內探究二氮嗪對冠心病大鼠血管內皮損傷的作用,并進一步明確其機制,為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級健康SD 大鼠30 只,雌雄各半,由廣東省醫學實驗動物中心提供。體質量(220±20)g,分籠飼養,每籠1 只,室溫20～22 ℃,相對濕度60%～65%,期間自由飲水,定時攝食,日光照12 h。所有動物實驗均經倫理委員會批準。

1.1.2 試劑及藥品 垂體后葉注射液[安徽宏業藥業有限公司生產,國藥準字H34022977;規格:1 mL(6 U),10支];二氮嗪(上海博頓生物化工有限公司生產,批號:100203-201301,純度:99.95%);大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國RD 公司生產);實時熒光定量逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(日本TaKaRa 公司生產);兔抗鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、兔抗鼠成纖維細胞生長因子2(FGF-2)單克隆抗體、兔抗鼠血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(美國Abcam 公司生產);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Invitrogen 公司生產);血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)試劑盒(南京建成生物工程研究所生產);蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司生產)。

1.1.3 主要儀器 UV-9100 紫外分光光度計(美國Mettler Toledo 公司生產);Mini Protean 3 cell 電泳儀、Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(美國Bio-Rad 公司生產);Pureloab Classic UVF 超純水儀(法國ELGA Labwater 生產);HITACH17080 全自動生化分析儀(上海曼普生物科技有限公司生產)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 30 只SD 大鼠隨機分為對照組、模型組和二氮嗪組,每組10 只。模型組和二氮嗪組大鼠給予高脂飼料喂養6 周,飼料配方為1.0%膽固醇、5.0%蛋黃粉、10.0%豬油、0.5%膽酸鈉、83.5%基礎飼料。造模完成后,二氮嗪組大鼠給予3 mg/kg 二氮嗪灌胃治療,每日1 次,連續給藥4 d。對照組及模型組大鼠給予等體積生理鹽水,每日1 次,連續給藥4 d。

1.2.2 血清炎性因子水平檢測 用50 mg/kg 苯妥英鈉腹腔注射麻醉大鼠,取腹主動脈全血5 mL,室溫靜置4 h,4 ℃、3 000 r/min 離心15 min(離心半徑10 cm),分離上層血清,采用ELISA 試劑盒檢測上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量,向加入一抗的96 孔板中加入40 μL待測樣品及10μL 生物素標記抗體,隨后加入100 μL辣根過氧化物酶標記抗體,室溫孵育60 min,清洗孔板后加入顯色劑。使用酶標儀在450 nm 下測定OD 值。所有試驗重復3 次。

1.2.3 血脂指標水平檢測 取腹主動脈全血5 mL,室溫靜置4 h,4 ℃、3 000 r/min 離心15 min(離心半徑10 cm),分離上層血清,采用全自動生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等血脂指標水平。

1.2.4 血管內皮損傷指標水平檢測 AngⅡ水平檢測采用ELISA 法,參照試劑盒要求嚴格進行操作,檢測血清AngⅡ水平。采用高效液相色譜分析檢測非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)水平,取腹主動脈全血5 mL,加入乙二胺四乙酸(Na2EDTA)抗凝,4 ℃、3 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm),收集血漿,分析血漿中ADMA 含量。

1.2.5 心功能檢測 用50 mg/kg 苯妥英鈉腹腔注射麻醉大鼠,麻醉生效后,由心房瓣插入球囊,鏈接壓力換能器,采集血流動力學信號,記錄左室收縮壓(LVSP)、左心室壓力變化最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室壓力最大下降速率(-dp/dtmax)。同時分離大鼠冠狀動脈左旋支根部,放置微型電磁流量探頭,采集血流動力學信號,記錄冠狀動脈血流量(CF)。

1.2.6 心肌細胞形態檢測 處死大鼠后,取適量左心室組織均勻切成4 μm 厚片,4% 多聚甲醛中固定過夜。常規乙醇梯度脫水,石蠟包埋。隨后將切片置于二甲苯及梯度乙醇中依次浸泡脫蠟,采用蘇木素-伊紅(HE)染色。梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂覆蓋玻片封固。于光學顯微鏡下觀察并采集圖片,觀察心肌組織形態。

1.2.7 心肌組織血管生成因子mRNA 表達檢測 用50 mg/kg 苯妥英鈉腹腔注射麻醉大鼠,頸椎脫臼法處死大鼠,取每只大鼠心肌組織約50 mg,采用Trizol 法提取心肌組織細胞總RNA。采用紫外分光光度儀測定總RNA 濃度與純度,A260/280 在1.8～2.0。參照mRNA 反轉錄試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒操作說明進行反轉錄和多重逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測,反應程序:95 ℃2 min,95 ℃15 s,60 ℃30 s,68 ℃ 60 s,40 個循環,最后95 ℃15 s,60 ℃1 min,95 ℃1 5 s 收集熒光信號,計算相對定量結果。所有的試驗均重復 3 次,相對定量分析按照2-△△Ct(實驗組)-△△CT(對照組)求出FGF-2 及VEGF mRNA 表達水平。FGF-2、VEGF 引物及內參GAPDH 引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成,基因FGF-2正向引物5'-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3',反向引物5'-GCCCAGTA ACAGTACAGAACGA-3';基因VEGF正向引物5'-ATGAACTTTCTGCTCTCTTGGGTACA-3',反向引物5'-GCAGATGGACAAGCCAAGGCGGTG-3';基因GAPDH 正向引物5'-GATGCTGGTGCTGAGTATGRCG-3',反向引物5'-GTGGTGCAGGATGCATTGCTCTGA-3'。

1.2.8 心肌組織血管生成因子蛋白表達檢測 取每只大鼠心肌組織約50 mg,加入蛋白提取液,冰上充分碾磨,4 ℃、10 000 r/min 離心10 min(離心半徑10 cm),取上清液。采用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量,以30～60μg 蛋白上樣量,煮沸變性。取蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜,90 V 恒壓模式電泳,220 mA 電轉90 min。5%脫脂奶粉封閉1 h 后,使用抗FGF-2 抗體(1∶1 000)、抗VEGF 抗體(1∶1 000)、抗GAPDH 抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過夜。PBS-Tween20液漂洗,辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗反應,再次用PBS-Tween20 液洗膜,增強化學發光(ECL)顯色,凝膠成像儀中曝光并拍照,檢測大鼠心肌組織中FGF-2及VEGF 等血管生成因子蛋白表達。灰度值用Image Pro Plus 6.0 軟件來測定。每組實驗重復3 次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析。采用Shapro-Wilk 檢驗數據是否符合正態分布,采用Bartlett 檢驗進行方差齊性檢驗。符合正態分布的定量資料以均數±標準差(±s)表示,多組數據間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析,兩組數據間均數比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3 組大鼠血清炎性因子水平比較 血清ELISA實驗檢測結果顯示,與對照組比較,模型組及二氮嗪組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平明顯升高(P＜0.05);與模型組比較,二氮嗪組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平則明顯降低(P＜0.05)。詳見表1。

表1 3 組大鼠血清炎性因子水平比較(±s) 單位:ng/L

表1 3 組大鼠血清炎性因子水平比較(±s) 單位:ng/L

與對照組比較,①P ＜0.05;與模型組比較,②P ＜0.05。

組別 只數 TNF-α IL-1β IL-6對照組 10 7.43±1.09 3.68±0.21 1.02±0.43模型組 10 23.43±3.48① 9.14±0.31① 25.34±2.43①二氮嗪組 10 13.54±3.41①② 6.17±0.37①② 16.43±2.83①②

2.2 3 組大鼠血脂水平比較 模型組及二氮嗪組血清TC、TG、LDL-C 水平均明顯高于對照組(P＜0.05),HDL-C 水平則明顯低于對照組(P＜0.05);二氮嗪組血清TC、TG、LDL-C 水平明顯低于模型組(P＜0.05),HDL-C 水平明顯高于模型組(P＜0.05)。詳見表2。

表2 3 組大鼠血脂水平比較(±s)單位:mmol/L

表2 3 組大鼠血脂水平比較(±s)單位:mmol/L

與對照組比較,①P ＜0.05;與模型組比較,②P ＜0.05。

組別 只數 TC TG LDL-C HDL-C對照組 10 1.34±0.73 0.67±0.12 0.16±0.05 0.62±0.11模型組 10 4.76±0.67① 4.02±0.77① 2.87±0.45① 0.41±0.14①二氮嗪組 10 3.04±0.56①② 2.12±0.64①② 1.14±0.36①② 0.55±0.12①②

2.3 3 組大鼠血管內皮損傷標志物水平比較 與對照組比較,模型組及二氮嗪組血清AngⅡ和ADMA 水平明顯升高(P＜0.05);二氮嗪組血清AngⅡ和ADMA水平明顯低于模型組(P＜0.05)。詳見表3。

表3 3 組大鼠血管內皮損傷標志物水平比較(±s)

表3 3 組大鼠血管內皮損傷標志物水平比較(±s)

與對照組比較,①P ＜0.05;與模型組比較,②P ＜0.05。

組別 只數 AngⅡ(pg/mL) ADMA(μmol/L)對照組 10 537.31±22.21 0.45±0.05模型組 10 692.31±25.46① 0.83±0.06①二氮嗪組 10 577.33±15.64①② 0.56±0.04①②

2.4 3 組大鼠心功能指標水平比較 模型組及二氮嗪組大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及CF 明顯低于對照組(P＜0.05);與模型組比較,二氮嗪組+dp/dtmax、LVSP、-dp/dtmax及CF明顯升高(P＜0.05)。詳見表4。

表4 3 組大鼠心功能指標水平比較(±s)

表4 3 組大鼠心功能指標水平比較(±s)

注:1 mmHg=0.133 kPa;與對照組比較,①P ＜0.05;與模型組比較,②P ＜0.05。

組別 只數 LVSP(mmHg) +dp/dtmax(kPa/s) -dp/dtmax(kPa/s) CF(mL/min)對照組 10 104.54±10.32 2 815.42±110.34 2 332.41±122.42 102.42±5.43模型組 10 67.42±5.44① 1 432.42±87.32① 1 223.42±77.42① 70.42±5.45①二氮嗪組 10 96.34±4.38①② 2 493.42±96.42①② 1 943.43±65.54①② 87.43±5.37①②

2.5 3 組大鼠心肌細胞形態變化 HE 結果顯示,對照組大鼠心肌細胞形態正常,細胞排列整齊、緊密,無明顯炎性水腫表現;模型組大鼠心肌細胞排列紊亂,細胞間水腫明顯,炎性浸潤表現,核仁萎縮,成簇狀改變;二氮嗪組大鼠心肌細胞排列相對整齊,細胞間質水腫緩解,核仁清晰可見。詳見圖1。

圖1 3 組大鼠心肌細胞形態變化(HE,×100)

2.6 3 組大鼠心肌組織血管生成因子表達量比較RT-PCR 實驗及Western Blot 實驗結果顯示,模型組與二氮嗪組大鼠心肌組織中FGF-2、VEGF 的mRNA及蛋白表達水平明顯低于對照組(P＜0.05),其中,模型組大鼠心肌組織中FGF-2、VEGF 的mRNA 及蛋白表達水平明顯低于二氮嗪組(P＜0.05)。詳見圖2。

圖2 3 組大鼠心肌組織血管生成因子表達量比較

3 討 論

冠心病為冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變,引起血管腔狹窄或阻塞,從而造成心肌缺血、缺氧的心血管疾病,近年來發病率呈逐年上升趨勢,且趨于年輕化[6]。冠心病不僅可直接引起心肌缺血、缺氧,還可導致部分心肌細胞凋亡,嚴重威脅病人生命安全。mito-KATP是一種廣泛存在于機體各類血管及平滑肌的離子通道,主要受細胞內ATP 濃度調控,1991 年被首次發現表達于大鼠肝細胞線粒體內膜[7-8]。研究指出,mito-KATP 開放劑可用于保護缺血后心肌組織,主要通過激活心肌細胞線粒體ATP,使線粒體膜電位發生去極化[9]。有研究建立老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注模型,從線粒體膜穩定作用出發,發現mito-KATP 開放劑尼可地爾是通過降低大鼠血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)的含量,提高心肌細胞線粒體膜電位,抑制心肌細胞凋亡,發揮心肌細胞保護作用[10]。目前關于mito-KATP 及mito-KATP 開放劑的心肌保護作用研究主要圍繞調控氧化應激、減少線粒體鈣離子超載、降低心肌細胞凋亡和平衡線粒體膜電位展開,但關于mito-KATP 開放劑對冠心病病人血脂代謝及血管內皮損傷影響的研究則鮮有報道。

研究指出,血脂代謝異常是誘發冠心病的重要危險因素之一,血脂指標長期異常,可影響血管內皮細胞結構和功能,破壞血管內皮完整性,并介導血小板長期聚集發生鈣化,最終導致動脈狹窄甚至閉塞,進而影響冠心病的發生[11-12]。有關文獻指出,高三酰甘油血脂是影響冠心病的獨立危險因素,TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平異常與不良心血管事件的發生密切相關[13]。本研究以高脂飲食飼養聯合腹腔注射腦垂體后葉素構建大鼠冠心病模型,探究mito-KATP 開放劑二氮嗪對實驗動物血管內皮損傷的影響及作用機制,研究結果顯示,模型組血清TC、TG、LDL-C 水平高于對照組,HDL-C水平則較對照組降低,二氮嗪組血清TC、TG、LDL-C則低于模型組,HDL-C 水平則較高,說明mito-KATP開放劑二氮嗪可降低冠心病大鼠血脂指標水平,提示二氮嗪具有一定的降血脂作用。

炎性反應貫穿冠心病發生發展的全過程,有研究發現,冠心病病人血清TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎因子水平較高[14]。炎性因子高表達不僅影響動脈斑塊和血栓形成速度,還可增加血管通透性,因此,炎性細胞因子也被作為冠心病的治療靶點[15]。本研究觀察到,模型組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均明顯高于對照組,使用二氮嗪干預的冠心病大鼠血清炎性因子水平則明顯降低,且HE 染色觀察結果顯示,二氮嗪組大鼠心肌細胞炎性浸潤狀態明顯緩解,細胞間質水腫減輕,提示二氮嗪可緩解冠心病大鼠心肌炎癥狀。

二氮嗪又名氯甲苯噻,其心肌缺血保護作用主要與清除氧自由基、降低心肌耗氧、抑制心肌細胞凋亡和抑制鈣離子超載有關[16-17]。本研究發現,模型組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、CF 等心功能指標水平明顯低于對照組,而二氮嗪組各項心功能指標水平較模型組改善,提示二氮嗪對冠心病大鼠心功能具有明顯保護作用。作為一種血管活性肽,AngⅡ可參與介導內皮損傷,在眾多心血管事件的發生發展中起重要作用[18]。動物實驗證明,高脂飲食誘發內皮損傷大鼠等心血管疾病動物血清內源性ADMA 濃度顯著升高,并伴有不同程度血管內皮舒張功能障礙,表明血清AngⅡ和內源性ADMA 含量升高是心血管內皮損傷的原因之一[19]。本實驗探究血清AngⅡ、ADMA 表達發現,模型組血清AngⅡ、ADMA 表達明顯升高,而二氮嗪組血清Ang Ⅱ、ADMA 表達則較模型組下調,提示二氮嗪可改善冠心病大鼠血管內皮功能障礙。

血管生長因子FGF-2 和VEGF 是血管形成過程中的重要因子。FGF-2 主要通過激活蛋白酶原活化因子和血管內皮細胞分泌蛋白酶,分解血管基底膜,促進細胞向細胞基質遷移,誘導新血管管腔形成[20-21]。VEGF 是一種高度特異性的促血管生長因子,主要與血管內皮細胞的特異性增殖、分化有關,在促進新生血管生成、改善血管壁通透性、促進受損血管內皮修復中扮演著重要角色,是血管內皮功能和側支循環建立的重要保障[22-23]。本研究結果顯示,冠心病模型大鼠心肌組織中FGF-2 和VEGF mRNA、蛋白表達均下調,給予二氮嗪干預后冠心病大鼠心肌組織中FGF-2 和VEGF mRNA、蛋白表達量上調,提示二氮嗪可升高冠心病大鼠心肌組織FGF-2 和VEGF 含量,從而減輕血管內皮損傷。

綜上所述,mito-KATP 開放劑二氮嗪能降低冠心病大鼠血清炎性因子表達和血脂代謝,改善大鼠心功能,減輕冠心病大鼠血管內皮損傷,從而發揮心肌保護作用。